с помощью клеточек любой из нас сможет нарисовать красивую картину. а есть нейтральные темы к примеру рисунки по клеточкам еда а так же иллюстрации по клеточкам животные.
Risunki Po Kletochkam Slozhnye S Izobrazheniyami Poperechnye
рисунки по клеточкам животные большие. так как рисунки не большие они хорошо подойдут для начинающих. в коллекции марио комиксы портреты животные. домашние любимцы или лесные зверушки есть и сказочные такие как единорог.
в подборке большие картинки и ричунки для больших картин по клеточкам. легкие картинки для старта маленькие изображения. Sign in to like videos comment and subscribe.
советы и правила как рисовать в тетради прикольные рисунки по клеточкам красивые и легкие картинки для мальчиков и девочек. в нашей статье представлена коллекция рисунков по клеточкам в тетради. как рисовать животные по клеточкам.
большие рисунки по клеточкам что может быть проще чем рисовать карандашом по клеточкам. предлагаем вам подборку больших рисунков по клеточкам. еды животных смайликов и другий.
рисунки животных по клеточкам в тетради подойдут для самых маленьких всегда можно найти пример любого уровня сложности. рисунки по клеточкам сложные и большие ничем не уступают настоящим картинам. есть как простые и маленькие так и большие и сложные рисунки их уровень.
что нужно для рисования по клеточкам как рисовать по клеткам в большом формате образцы легких рисунков по клеткам для начинающих красивые крупные рисунки в тетради а4 большие и сложные рисунки для профи черно. огромный выбор картинок для срисовки. животные смайлики для личного.
3d Risunki I Risunki Po Kletkam Vk S Izobrazheniyami Obrazec
Risunki Po Kletochkam V Tetradi Uzory Dlya Holsta Shemy Dlya
Risuem Po Kletochkam 8 Bolshih Shablonov Dlya Zanyatij S Detmi S
Risunki Po Kletochkam S Izobrazheniyami Risunki Piksel Art
Kartinki Po Zaprosu Milye Risunki Po Kletochkam Pikselnye
Krot Yaponskie Krossvordy Otvety Risunki Kletkam Vk Modeli
Kartinki Po Zaprosu Malenkie Risunki Po Kletochkam Dlya Nachinayushih
I Drew This On A Piece Of Paper Anime Pokemon Minecraft Kunst
Risunki Po Kletochkam Vk Uzory Dlya Holsta Modeli Stezhkov
Prikolnye Risunki Po Kletochkam Kartinki Risunki Pikselnye
Risunki Po Kletochkam 55 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks
Risunki Po Kletochkam Pchela Pixel Art How To Draw A Bee Malen
Fenechki I Shemy Po Anime Serialam Igram I Td Vk Risunki
Enot Risunki Po Kletochkam Enoty Risunki Zhivotnye Iz Bisera
Kartinki Po Zaprosu Malenkie Risunki Po Kletochkam Dlya Lichnogo
Kartinki Po Zaprosu Kak Risovat Po Kletochkam Zhivotnyh S
Risunki Po Kletochkam Slozhnye Pikselnye Izobrazheniya Minecraft
Enot Cherno Belyj Risunki Po Kletochkam Enoty Illyustracii Lisy
Risunki Po Kletochkam Vk S Izobrazheniyami Pikselnye
картинки для рисунков по клеточкам в тетради.
красивые и интересные рисунки приколы школьные изображения на тему рисунки по клеточкам в тетради для начинающих для девочек.
Kartinki Po Zaprosu Risunki Po Kletochkam Dlya Nachinayushih Risunki
сложные рисунки по клеточкам в тетради для начинающих. есть как простые и маленькие так и большие и сложные рисунки их уровень. рисунок карандашом по клеточкам в тетради для начинающих начинающим помощь в таком деле не помешает. здесь изображены рисунки по клеточкам для девочек возьмите в руки карандаши или фломастеры и вперед творить чудеса в тетради.
я с удивлением обнаружила что рисунки по клеткам еще называют графический диктант. нарисовать какую нибудь прикольную вкусняшку по клеточкам тоже несложно. в нашей статье представлена коллекция рисунков по клеточкам в тетради.
вы узнаете как создавать рисунки по клеточкам от простого к сложному найдёте шаблоны рисунков научитесь создавать собственные схемы. еды животных смайликов и другий. сегодня у меня творческая тема в которой я вам расскажу и поэтапно покажу что такое рисунки по клеточкам в тетради они будут легкие и сложные на разные темы и для разного возраста.
рисунки по клеточкам в тетради для девочек. на нашем сайте вы найдете лучшие осенние открытки и рисунки на разнообразные темы. легкие и маленькие но красивые.
огромный выбор картинок для срисовки. как создавать рисунки по клеточкам от простого к сложному 3д среднего размера. вот например еда из макдональдса гамбургер.
советы и правила как рисовать в тетради легкие рисунки по клеточкам красивые и легкие картинки для детей. картинки среднего размера для начинающих черно белые карандашом. такие легкие картинки очень популярны у начинающих художников.
все рисунки можно делать как в тетради так и на отдельных листках в клетку. правила выполнения и советы легкие и красивые рисунки для детей 6 7 лет схемы для девочек мальчиков еда.
Kartinki Po Zaprosu Slozhnye Risunki Po Kletochkam Risunki
Pin Na Doske Picturse
Risunki Po Kletochkam Pikselnye Izobrazheniya Minecraft Risunki
Risunki Po Kletochkam 55 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks
Risunki Po Kletochkam V Tetradi Slozhnye Termomozaika Pikselnye
Risunki Po Kletochkam 20 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks
Risunki Po Kletochkam 20 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks
Risunki Po Kletochkam V Tetradi Pikachu Multyashnye Risunki
Risunki Na Polyah Tetradi Foto 9 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks
Risovat Po Kletochkam Prostye I Slozhnye Kartinki Shema S
Risunki Po Kletochkam S Izobrazheniyami Risunki Piksel Art
Risunki Po Kletochkam Shemy Pikselnye Risunki Piksel Art
Pin Ot Polzovatelya Nigai Na Doske Chelo Risunki Pikselnye
Kartinki Po Zaprosu Kak Risovat Po Kletochkam Risovat Risunki
Risunki Po Kletochkam 19 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks
Risunki Po Kletochkam V Tetradi Kartinki Slozhnye Legkie S
Risunki Po Kletochkam 67 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks
Pin Na Doske Kartinki Po Kletochkam
Risunok Popugaya Po Kletochkam Pikselnye Izobrazheniya Minecraft
Научиться этому искусству сможет… Нравится придумывать новые блюда, необычно украшенные торты, экзотические фрукты и другие вкусности? Всё, что готова создать ваша фантазия, легко уместиться на… Не отставайте от своих сверстников, скорее учитесь рисовать картинки по клеточкам Майнкрафт. Придумайте свою художественную историю этой увлекательной игры. Воз… Чтобы не было скучно на переменках или в поездке, научитесь рисовать по клеточкам Майнкрафт. Изображение главных героев, локаций, домов и других объектов на бум… Всем маленьким поклонникам компьютерных игр наверняка интересно как нарисовать по клеточкам Майнкрафт. Не всегда есть возможность воспользоваться планшетом для… Видели, как увлечённо ваши одноклассники создают рисунки по клеточкам Майнкрафт? Немного усидчивости, фантазии и на бумаге появляется новый герой игры, заполнен… Играть в развивающие компьютерные игры, такие как Майкрафт – это очень интересно. Дети могут часами просиживать в ней. Никто не откажется от возможности поискат…Красиво рисовать — могут единицы! А тем, у кого нет особенных способностей – о рисовании остается только мечтать! Ну и любоваться чужими рисунками, конечно же! Еще совсем недавно – так и было! Но теперь – все изменилось, потому что с помощью клеточек любой из нас сможет нарисовать красивую картину! Да-да! Рисунки по клеточкам сложные и большие – ничем не уступают по красоте настоящим картинам!
В детстве многие мечтают стать настоящим художником! Это же так здорово – рисовать красивые рисунки, дарить их своим друзьям и близким! Увы, не всем даны способности и таланты, поэтому чаще всего, в будущем приходится выбирать совсем другие профессии! А на красивые картины – любоваться на выставках! Но сегодня – все изменилось. И нарисовать их сможет каждый! Ведь теперь есть картинки по клеточкам!
Отсчитав нужное количество клеточек и закрасив их в определенный цвет, вы сможете нарисовать красивый портрет, пейзаж, любимого персонажа или целый сюжет! Вам потребуется немало терпения и внимательности, но результат того стоит! Для больших рисунков лучше всего подойдет миллиметровая бумага, но можно использовать и обычные листы в клетку, склеив их в один большой лист! Хотите попробовать нарисовать настоящую большую картину?
С помощью клеточек можно нарисовать все, что угодно.
В тетради или блокноте – небольшие рисунки цветов, животных или любимых персонажей, на большом тетрадном листе – красивую композицию, а на листе миллиметровой бумаги – даже огромный натюрморт или портрет! Все зависит только от сложности выбранного вами образца для перерисовки. Конечно, начинать сразу с огромных картин – не стоит, но если постараться, можно очень быстро перейти от самых простых картинок к гораздо более сложным!
Более сложные рисунки подойдут тем кто уже натренировался на и рисунках по клеточкам, и желает попробовать нарисовать что-то более сложное. В нашей галерее представлены как портреты так и и просто классные рисунки по клеточкам для срисовки в тетради.
Для более сложных рисунков лучше подойдёт миллиметровая бумага.
В Живую это выглядит примерно вот так:
А здесь вы можете заказать классный портрет с использованием технологии флип-арт.
Технология флип-арт, это рисование с использованием красок и трафарета.
В школе часто ребята украшают свои тетради в клеточку разнообразными рисунками. Это могут быть переплетенные цветные косички, орнаменты, рисунки по клеточкам. Предлагаю вам подборку шаблонов таких узоров и рисунков для украшения ваших тетрадок.
С помощью цветных карандашей или фломастеров можно нарисовать в тетради (или в личном дневнике) красивый рисунок. Например, вот такого очаровательного котенка.
По клеточкам можно рисовать что угодно. Вот еще рисунок, на котором из яблока получается огрызок. Правда забавно?
По клеточкам можно рисовать даже героев компьютерных игр.
Поклонникам мягких игрушек и мишек Тедди — вот такой милый мишка по клеточкам.
Кроме рисунков можно красиво оформлять поля тетрадей в клеточку. Самые простые — это косички. Смотрите как они легко рисуются по клеточкам.
Кроме косичек можно делать очень оригинальные цветные орнаменты.
Вот орнамент с сердечками и простые орнаменты на 3 клетки.
Можно не просто рисовать узоры по клеточкам, но и раскрашивать их в разные цвета. Посмотрите какие красивые получаются орнаменты, если добавить красок!
А кроме обычных узоров по клеточкам можно добавить плавных линий и тогда получится шедевр.
Вы можете не только перерисовывать готовые узоры, но и придумывать свои уникальные орнаменты. Попробуйте, это очень интересно рисовать узор на тетрадках в клеточку!
Красиво рисовать — могут единицы! А тем, у кого нет особенных способностей – о рисовании остается только мечтать! Ну и любоваться чужими рисунками, конечно же! Еще совсем недавно – так и было! Но теперь – все изменилось, потому что с помощью клеточек любой из нас сможет нарисовать красивую картину! Да-да! Рисунки по клеточкам сложные и большие – ничем не уступают по красоте настоящим картинам!
В детстве многие мечтают стать настоящим художником! Это же так здорово – рисовать красивые рисунки, дарить их своим друзьям и близким! Увы, не всем даны способности и таланты, поэтому чаще всего, в будущем приходится выбирать совсем другие профессии! А на красивые картины – любоваться на выставках! Но сегодня – все изменилось. И нарисовать их сможет каждый! Ведь теперь есть картинки по клеточкам!
Отсчитав нужное количество клеточек и закрасив их в определенный цвет, вы сможете нарисовать красивый портрет, пейзаж, любимого персонажа или целый сюжет! Вам потребуется немало терпения и внимательности, но результат того стоит! Для больших рисунков лучше всего подойдет миллиметровая бумага, но можно использовать и обычные листы в клетку, склеив их в один большой лист! Хотите попробовать нарисовать настоящую большую картину?
С помощью клеточек можно нарисовать все, что угодно.
Более сложные рисунки подойдут тем кто уже натренировался на и рисунках по клеточкам, и желает попробовать нарисовать что-то более сложное. В нашей галерее представлены как портреты так и и просто классные рисунки по клеточкам для срисовки в тетради.
Для более сложных рисунков лучше подойдёт миллиметровая бумага.
В Живую это выглядит примерно вот так:
А здесь вы можете заказать классный портрет с использованием технологии флип-арт.
Технология флип-арт, это рисование с использованием красок и трафарета.
4.7 (93.8%) 158 votes
Рисунки по клеточкам или пиксель арт очень популярный вид искусства у школьников и студентов. На нудных лекциях рисунки по клеточкам спасают от скуки.Прототипом рисования по клеткам послужило вышивание крестиком, где на канве, ткани размеченной клеточками, наносили рисунок крестиком. Все мы были когда-то студентами и школьниками и рисовали от скуки разные картинки в клеточках, каково же было мое удивление, когда я узнал, что это практически искусство со своими шедеврами и гениями. Я стал изучать вопрос подробнее и вот что из этого вышло…
Это искусство доступно любому, главное следовать четко по клеточкам. Для нанесения изображения идеально подходят школьные тетради, размер их квадратиков 5х5 мм, а самой тетради 205 мм на 165 мм. На данный момент у художников по клеточкам набирают популярность пружинные тетради-блокноты с листом формата А4, размер этого блокнота 280мм на 205мм.
Профессиональные художники творят свои шедевры на миллиметровках (чертежной бумаге), вот уж где места разгуляться.
Для раскрашивания рисунков по клеточкам не нужны никакие специальные инструменты, подойдут любые карандаши и ручки. Монохромные картины это очень здорово, но так хочется добавить в жизни красок. Для того, чтоб краски стали разнообразными, зайдите в канцелярский магазин и выбирайте все что душе угодно, гелевые ручки, масляные, шариковые.
Если же вы любите рисовать фломастерами, ваше право, расцветка фломастеров очень богата. Стоит помнить, что фломастеры делятся на две группы: спиртовые и водные, водные безопасней, но они могут размочить бумагу. Спиртовые также могут размачивать бумагу, еще и запах сильно на любителя.
Карандаши, еще один из видов зарисовывающих приспособлений. Карандаши не исключение в разнообразии видов, они бывают пластиковыми, восковыми, деревянными и акварельными. Деревянными мы рисуем с раннего детства, и знаем, что они часто ломают грифель. Пластиковые и восковые ломаются реже, но они более толстые, что будет менее удобно в рисовании. Об акварельных карандашах не может быть и речи, так как после закрашивания карандашом нужно покрывать рисунок увлажненной кисточкой, а это недопустимо для тетрадных листов.
Посмотрите видео о том, как просто рисовать рисунки по клеточкам и как красиво может быть в результате:
Еще несколько схем рисунков, которые мне понравились:
В том, какие нужны принадлежности, мы разобрались, теперь познакомимся с технологией.
Технология пиксель арта очень проста, это точечная графика.
Перед тем, как приступить к рассмотрению способов пиксель арта, вернемся в детство 80х -90х годов. Конечно, те, кто рос в постсоветское время, помнит 8-ми битные видеоигры, игровая графика, которых, построена на пиксельной графике.
Лучший способ освоить, что-либо это практика, давайте попробуем освоить пиксель арт:
Возьмем черную и красную масляную ручку, и тетрадный лист в клеточку.
Для начала сделаем простенький рисунок. Посчитаем клетки, определим контур и разукрасим согласно цветам.
К примеру, нарисуем сердечко:
Если вам кажется, что большие и объемные картинки не для вас, стоит попробовать нарисовать фотографию из интернета. Испугались? Не стоит.
Возьмите
Для нанесения объемных рисунков нам нужно посчитать количество клеток, которые будут закрашены. Довольно трудно не ошибиться на больших количествах. Еще обязательно подберите оттенки цветов схожие с исходным изображением.
Итак, действуем:
Дам один совет, который очень мне помогает, если у вас есть цветной принтер, распечатайте рисунок, если нет, не страшно. Прочертите сетку по 10 клеток более жирным контуром. На напечатанном листе с помощью линейки и контрастной ручки, если распечатать негде, то можно открыть изображение в Paint.
Творческих вам успехов.
Рисунки по клеточкам — хороший способ интересно скоротать свободное время. Это не только увлекательно, но и полезно. Рисование по клеткам развивает творческое мышление, улучшает координацию, имеет успокаивающее действите на нервную систему. Рисуйте в удовольствие!
Чёрный кот / Black cat:
Пандочка / Panda:
Три яблока / Three apples:
Муравей / Ant:
Божья коровка / Ladybug:
Ангел-солнышко / Angel sun:
Сердечко и нота / Heart and note:
Сердечко / Heart:
Лёгкие — Цветок / Flower:
Зелёное яблоко / Green apple:
Черепок / Skull:
Лицо / Face:
Герой мультфильма / Cartoon Hero:
Сложные — Винни-Пух / Winnie Pooh:
Андроид / Android:
Бант / Bow:
Печаль / Sadness:
Медвежонок в цвете / Bear in color:
Схемы — Ёлочка / Spruce:
Девушка / Girl:
Птица-персонаж / Hungry bird:
Любовь / Love:
Картинки — Симпсон / Simpson:
Мегги Симпсон / Maggie Simpson:
Девушка / Girl:
Маша / Masha:
Девушка-блондинка / Blonde girl:
Для девочек — Гам-ган стайл / Dandam style psy:
Я люблю шоколад / I like chocolate:
Супермен / Superman:
Метал / Metal:
Печалька / Sadness:
Для начинающих — Тучка / Cloud:
Гитара / Guitar:
Из мультфильма / From cartoon:
Солнышко / Sun:
Маленькие — Мороженое / Ice cream:
Голодная птичка / Hungry bird:
Голодная птичка 2 / Hungry bird 2:
Влюблённый парень / Boy in love:
Супер Марио / Super Mario:
Лучшие друзья:
Красивые — Снеговик / Snowman:
AC/DC:
Флаг Америки / American Flag:
Сердечка / Hearts:
Красное яблоко / Red apple:
Вшоке / Vshoke:
Рисунки по клеточкам — прекрасный способ увлечь себя во время скуки.
Рисовать легко и просто — нужно всего лишь следовать за уже готовой геометрией тетради — небольшими квадратиками. Размеры квадратиков очень удобны — пять на пять миллиметров. Для рисования прекрасно подходят обычные школьные тетради форм-фактора 205мм*165мм (высота — двадцать сантиметров и пять миллиметров, ширина — шестнадцать сантиметров и пять миллиметров). В таких тетрадках в вашем распоряжении для творчества будет доступно 1353 квадрата (одна тысяча триста пятьдесят три). Но это ещё не все! В последнее время стали популярными так называемые студенческие форматы тетрадей — по форм-фаткору они имеют больший размер который почти равен альбомному листу А4. Точные размеры такой студенческой тетради — двадцать восемь сантиметров в высоту и двадцать сантиметров пять миллиметров в ширину! Соответственно площадь полотна равна пятьсот семьдесят четыре сантиметра или две тысячи двести девяносто шесть квадратиков для рисования! Если же вам и этого мало — можете выйти на профессиональный уровень. Поясню что я имею ввиду: существуют намного большие полотна для рисования по клеточкам — это так называемые миллиметровки. Миллиметровка — или ещё как её называют, «масштабно-координатная чертёжная бумага» — это профессиональная профильная бумага для построения точных графиков, карт, черчения деталей. Условное сечение миллиметровки — один миллиметр! Есть также линии обозначающие стороны квадрата в пять миллиметров и один сантиметр, они выделяются на общем фоне толщиной линии. Небольшим недостатком миллиметровочной бумаги можно считать то что она имеет как правило не белый цвет — а зеленоватый или красноватый. Тем не менее при раскрашивании цветными ручками это не будет проблемой — всё и так будет в цвете. Одним словом, если вы заядлый фанат рисования по клеткам — миллиметровка будет для вас настоящим открытием. Это уже практически рисование по пикселях! Выбрав формат тетрадного листа для рисования, следует позаботиться также и о других физических характеристиках бумаги.
Среди них самыми важными являются два показателя — плотность и белизна.
Плотность например, напрямую влияет на то, будет ли просвечиваться рисунок или нет. Согласитесь, просветы — это не очень хорошо. Так вот — оптимальная плотность бумаги в тетради для рисования — пятьдесят пять грамм на квадратный метр (не меньше), если больше — это только на пользу. Белизна, это говоря простыми словами — оттенок белого цвета. Оптимальная белизна бумаги — восемьдесят два — девяносто шесть процентов. Тут также следует понимать — слишком белая — это не хорошо, слишком тёмная — тоже плохо. Тем не менее переживать за это не следует, ибо производители в своём большинстве делают тетради именно в диапазоне 82-96 процентов, как это заложено в государственные стандарты по изготовлению тетрадей.
Чем закрашивать клетки? Как правило раскрашивают тем что есть под рукой — чаще всего это простая шариковая ручка синего цвета, или карандашы — серого цвета. Но согласитесь, двумя цветами раскрашивать не очень прикольно! Тут на помощь нам приходит широкий спектр цветных ручек, карандашей, фломастеров, мелков. Купить их можно в любом отделе канцелярии, цены — довольно разные и зависят от производителя, количества цветов, бренда, качества. В любом случае выбор очень широк и вы обязательно найдёте что-нибудь для себя! Какие цветные ручки лучшие для творчества — обычные шариковые, гелевые, капилярные или же масляные? На наше твёрдое убеждение, для рисования по квадратикам лучше использовать шариковые или масляные ручки. Гелевые конечно очень яркие, но имеют большой недостаток — они размазываются по бумаге, что в итоге может испортить весь рисунок. Капилярные ручки очень похожи на фломастеры — они тоже яркие, но имеют другой недостаток — их чернило очень крепкое и часто пропитывает лист бумаги. Если есть возможность — надо покупать масляные ручки. Они не размазываются, не пачкают руки, очень гладко скользят по бумаге. Идеальный вариан для рисования по клеткам! Если же вы фанат фломастеров, то также знайте — они делятся на два больших подвида: на водной основе и на спиртовой основе.
Больше распространены фломастеры на водной основе — и не безосновательно, ведь они более безопасны. Также у такого типа фломастеров очень большой выбор цветов. Из недостатков — они могут промокать бумагу. Так что это не лучший вариант для рисования. Другой тип — спиртовые фломастеры. Сразу перейдя к недостаткам, отметим что они также могут просвечивать бумагу и к тому же имеют очень резкий спиртовый запах. Сомневаюсь что это вам понравиться! Третий инструмент для раскрашивания — карандаши. На сегодняшний день они делятся на четыре больших вида — деревянные цветные карандаши, акварельные, восковые и пластиковые. Деревянные карандаши знакомы всем нам ещё с детства, они хорошо подходят для рисования по клеточкам, но имеют один большой недостаток — часто ломаются. Не имеют этой проблемы другие два вида — восковые и пластиковые, но ихние контуры более толстые, что не очень хорошо для рисования по изящным квадратикам. И наконец акварельные карандаши — самый новый тренд. Их особенность — сначала рисовать нужно карандашом, а потом проявлять рисунок мокрой кисточкой. При всех преимуществах акварельных карандашей, использовать их для рисования по клетках не рекомендуем — будут промокания и просветы. Таким образом можно сделать небольшой вывод — лучше всего рисовать по квадратиках масляными ручками! Какие марки ручек, карандашей и фломастеров рекомендуется покупать? Итак, небольшой рейтинг: Ручки — BIC Cristal, BIC Декор, BIC Orange, BIC 4 COLORS FASHION. Карандаши — Koh-i-Noor, DERWENT, DALER ROWNEY, Faber Castell. Фломастеры — Crayola, RenArt, Centropen. Мелки — Rowney Perfix, Blair No Odor Spray Fix, Melissa & Doug, Kite, Радуга.
Приятного творчества!
Сегодня темой нашего разговора станут 3D-рисунки по клеточкам: развлечение в школьной тетради помнится нам еще с далеких времен уроков и перемен. Не стоит думать, что в этом занятии нет ничего полезного и развивающего, как могли бы нам сказать наши школьные учителя.
У каждого школьника есть тетрадь в клеточку.
Прилежные ученики делают в них задания учителей, в то время как другие дети тратят свое время на создание интересных картинок.
Это могут быть простые схематичные изображения и узоры, а могут быть мультипликационные персонажи или полноценные картины с определенным сюжетом и вдохновляющей графикой.
Если человек не знает, как провести свое свободное время, ему может помочь рисование. Разлинованная бумага помогает легче ориентироваться в пространстве, создавая интересные художественные шедевры.
Возможно, тебе просто самому лень разрабатывать сложные сюжеты. Но художественное творчество может включать и создание довольно простых узоров, состоящих из обыкновенных геометрических фигур.
Тем не менее, созданные таким простым способом рисунки вполне способны смотреться очень эффектно и интересно. И вы сможете почувствовать себя творцом настоящих шедевров, не прилагая для этого огромных усилий.
Не хотите рисовать сложные схемы? Наличие клеточек в тетради поможет вам не тратить свое драгоценное время на проведение дополнительной разметки пространства вашего будущего холста.
Если ты никогда не создавал картинки с помощью клеточек, то никогда не поздно будет начать экспериментировать в этом направлении. Если ты хочешь попробовать что-то новое, то не упусти свой шанс проявить свои творческие способности этим довольно простым, но интересным способом.
Развлекайся в свое удовольствие. Сам творческий процесс не менее важен, чем конкретный результат твоей работы. Тем более, первоначальные результаты, возможно, в чем-то неудачные, легко будет исправить с помощью старания и упорства, проявляющихся в дальнейших экспериментах в данном направлении.
Что можно нарисовать по клеточкам? В качестве одного из простых примеров можно привести .
Сейчас очень популярно рисовать разнообразных мультипликационных персонажей. Каких героев можно встретить на трехмерных рисунках:
Необязательно рисовать конкретных персонажей. Возможно, вам больше придется по вкусу милые животные.
Если вы хотите создать трехмерное изображение, то первоначально вам нужно будет определиться с его тематикой. Чтобы почерпнуть вдохновение, попробуйте посмотреть уже готовые работы, выполненные в этом жанре.
Когда вы определитесь с темой, можно приступать и к непосредственной работе над своим будущим шедевром. Возможно, на первых этапах вам будет лучше ограничиться самыми простыми рисунками без замысловатых сюжетов и интересных форм.
Клеточки будут помогать вам соблюдать пропорции. А если речь идет о композициях из простых геометрических фигур, то тетрадь в клетку — идеальный вариант вашего холста.
Клетки послужат вам специальной разметкой. Фактически, формы для рисования квадратиков для создания более сложных фигур уже заданы: осталось только обвести их с помощью карандаша.
Реалистичность — это желанное свойство трехмерного изображения в стиле 3D, однако не всем художникам удается добиться подобного эффекта. Для того, чтобы воплощение ваших творческих способностей смогло как будто бы сойти с поверхности холста, выйдя за его рамки, вам не нужно применять никакой специальной магии.
У профессиональных художников есть свои секреты, которые работают не хуже любого волшебства. И вот уже человечек как будто существует не в плоскости, а в объеме, перешагивая из одной среды в другую.
Для этого можно использовать самые различные эффекты . Самый простой способ — использование игры света и тени.
Кроме того, возможно использование и других нюансов. Например, не стоит забывать о том, что линии должны ложиться на плоскости немного не так, как они располагаются в пространстве.
Если вы хотите нарисовать глаз или милую панду, то клеточки также помогают вам в том, чтобы создать данные элементы. В этом случае клеточки будут служить элементарными элементами в рамках большой картины.
Представьте, что речь идет о графическом изображении, представленном на компьютере. Все мы знаем такое понятие, как пиксели.
Представьте, что клеточки тетради — это именно эти пиксели, задающие определенное разрешение фотографии или экрану компьютера.
Аналогичный способ представления комплексных изображений используется в схемах для рукоделия. На основе маленьких квадратиков элемент за элементом создается полноценное изображение подобно мозаике.
Многие школьники на скучных уроках любят рисовать на полях. Зачем они это делают?
Не стоит обвинять их в лени и нежелании учиться. Ведь желание рисовать — это проявление творческих способностей ребенка.
Рисование — это искусство. Но чтобы им овладеть в достаточной мере, необходима практика.
Упорство и труд являются необходимыми условиями для достижения поставленных целей. И если ребенок хочет развиваться в этом направлении, то не стоит его ограничивать в данном желании.
Пространственное мышление позволит начинающему художнику по-новому взглянуть на окружающие его в реальном мире объектов. Поняв общие принципы переноса линий из пространства на плоскость, вы сможете совершать данные манипуляции в автоматическом порядке путем нехитрых манипуляций.
Что вы хотите изобразить с помощью вашего нового шедевра изобразительного искусства? Будет ли это узор, объект городского ландшафта, пейзаж или персонаж из мультсериала?
К каждой теме необходимо подходить по-своему. Какие-то объекты будут более сложными для воспроизведения, а какие-то — менее.
Но тем не менее, в изобразительном искусстве в любом случае существует ряд законов, соблюдение которых обязательно вне зависимости от темы вашего творчества.
Кроме того, вы можете сгибать один лист или склеивать листы таким образом, чтобы зрителям казалось, что ваше изображение переходит из одной части холста в другую.
Если лист обладает четко видимой разметкой в виде квадратиков или прямых линий, вы можете изменить форму этих элементов непосредственно на вашем объекте.
Таким образом, будет создаваться полное ощущение, что ваш персонаж обладает объемом по сравнению с основной плоской поверхностью листа бумаги.
Кроме того, данный эффект можно усилить с помощью создания теней. Это можно делать с помощью различной степени нажатия карандаша на холст или с помощью использования письменных принадлежностей с различными параметрами жесткости и мягкости.
Несмотря на то, что рисунки на полях тетради многими учителями считается чуть ли не хулиганством, они все-таки обладают не только развлекательными, но и развивающими функциями. Вы сможете воплотить в жизнь свои творческие идеи и научиться рисовать.
С помощью клеточек вы сможете хорошо рассчитать масштаб и пропорции изображения. Для начинающего художника — это самый оптимальный способ набить руку, создавая свои первые рисунки.
Созданием рисунков 3Д на бумаге занимаются как дети, так и взрослые. Это удивительное занятие позволяет каждому человеку почувствовать себя настоящим волшебником, оживляющим изображение.
Часто те люди, которые только начали заниматься созданием необычных картин, задаются вопросом о том, как нарисовать 3D-рисунок на бумаге карандашом.
Сегодня можно найти много информации о том, как рисовать самые простые и распространенные среди новичков 3D-рисунки. Рассмотрим несколько уроков, как сделать это поэтапно:
Теперь вы знаете, как нарисовать 3Д-рисунок, который сможет удивить ваших близких и друзей. Нарисовать 3Д-рисунок на бумаге сможет каждый, если приложить немного усилий. С первых попыток может что-то не получиться, но это лишь дело времени. Главное — начать.
Не каждому удалось окончить художественную школу, чтобы научиться технике рисования. Если хотите сделать креативную открытку или заполнить дневник оригинальными рисунками, освойте рисование по клеточкам.
Маленькие картинки по клеточкам смогут сделать даже новички. Главное, купить тетрадку для математики со светлой бумагой.
Многие любят разгадывать японские кроссворды, в основу которых положено рисование по клеточкам. Если у вас есть готовые разгаданные кроссворды или ответы к ним, то сможете просто перерисовать в свою тетрадку большие фигуры.
Самый хороший способ использовать готовые схемы, которые были специально разработаны для тех, кто не умеет рисовать. Вы можете закрашивать по схеме клеточки в собственной тетради, а потом удивлять красивыми изображениями близких и родных.
Среди шаблонов вы найдете
Оригинально смотрятся фрукты по клеточкам . Если хорошо закрасить рисунок яркими фломастерами, то потом можно его вырезать и использовать для декора интерьера или украшения аппликации.
Хотите сделать открытку или описать в своем дневнике романтическую историю, тогда нарисуйте сердечко по клеткам.
Конфетки, букетики, цветочки – все это можно нарисовать по клеточкам.
Если вы освоите принцип, то потом сможете изображать все, что угодно в своей собственной тетради.
Хотите придумать свой собственный рисунок? Тогда сделайте легкую зарисовку, а потом начинайте превращать ее в рисунок по клеточкам. Начинать лучше всего с контура. Потом можете выделять мелкие детали. Не забудьте отметить, каким цветом, какая деталь должна быть выделена, чтобы рисунок получится ярким и красивым.
3D-рисунки по клеточкам – это хороший способ провести интересно досуг и реализовать свои творческие способности.
Вы еще ни разу не рисовали по клеточкам? Тогда обязательно попробуйте. Это занятие придется по душе как маленьким детям, так и взрослым. Специалисты отметили, что это хобби развивает творческое мышление, координацию движений при письме, концентрацию внимания и логику. Проводите досуг с пользой, выдумывая новые 3Д схемы простые и сложные для рисования по клеточкам.
Сложный рисунок по клеточкам
Предлагаем фото нескольких популярных схем для начинающих
Эта подборка не только для детей, но и взрослых она может заинтересовать. Здесь собраны самые классные, оригинальные и прикольные картинки. Вернее, не сами картинки, а заготовки для рисунков. А сделать из них настоящий шедевр – уже ваша задача. И очень надеюсь, что вам понравятся сюрпризы, которые я для вас подготовила. Рассказывайте друзьям об уникальной возможности творчески расти и развиваться, и оставляйте ссылку на статью в соцсетях.
Также рекомендую заглянуть в статью с рисунками по клеточкам, это первый вид рисования, который привлек моего сына. Вот рукой в пространстве рисовать ему никак не шло, а по клеточкам как-то быстро научился. И даже сам стал придумывать схемы. А ведь это очень полезно. Ребенок учится считать, понимать лево-право и осознает, что на самом деле все рисовать очень просто. После клеточных легко пошли и рисунки на чистом холсте.
Если нравятся единороги, то заходите сюда. Тут очень много мастер-классов по рисованию милых животных с нуля. А еще у меня есть коллекция рисунков для срисовки для девочек.
В чем суть этого сюрприза? Эта подборка картинок по возрастным группам! То есть, каждый может найти в ней что-то интересное для себя!
Итак, начнем с самых-самых маленьких, тех, кто только учится рисовать. Эти картинки-подсказки помогут им освоить первые азы в изобразительном искусстве, покажет, что пара-тройка точек может превратиться с их помощью в линию. А несколько линий станут целостной картинкой. Сначала мы покажем крохам, как нарисовать самые простые и понятные им рисунки. И это поможет малышам увлечься рисованием.
Клацайте по картинке и распечатывайте.
Когда малыши уже опробовали свои силы в рисовании, пора дать им более сложные, но интересные именно им задания.
А именно, те, что находятся в этой рубрике. Детки растут, их интересы и возможности меняются. И им уже рисовать цветочки и мишек как-то не так увлекательно, как тогда, когда они были крохами. Поэтому в этой категории картинки, соответствующие возрасту дошкольников или деток младших классов. Все эти точечные наброски очень простые в выполнении. Но на выходе получаются из них такие класснющие и красивющие рисунки, что детки убедятся, что любое задание им по силам, ведь они практически настоящие художники! Да и пора готовиться к школе! Учиться писать по точкам — просто и интересно.
И вот тут новый сюрприз! Я знала, что вас заинтересует не только возможность научиться рисовать, или почувствовать уверенность в своих художественных талантах. Но интересно и то, что подборка поможет создать большой и красивый рисунок. Все те же точки, но в итоге вы получите:
Да и просто рисовать большую картинку намного приятнее.
А для маленьких деток и картинки маленькие. Для этой возрастной группы такие картинки особенно полезные:
Я отнесла эти картинки в малышовскую категорию, но и постарше детки могут рисовать свои картинки при помощи этих шаблонов.
И вот мы добрались до брались до самого главного, просто бомбезного сюрприза! Картинки по точкам могут быть сложными!!! А значит, что и взрослые, и дети смогут с головой уйти в работу, на создание которой потребуется много времени и сил. Но все мы знаем, что чем больше мы вкладываемся в создание чего-то гениального, и оно у нас выходит на отлично, тем больше радости мы получаем от своего труда. А значит, в этой категории подборки вас ждут самые классные рисунки, которые подарят вам массу положительных эмоций.
Понравилась статья? Напишите в комментариях об этом и поделитесь своими успехами. И еще, подпишитесь на сайт. Не пожалеете! Вас ждет еще огромное количество сюрпризов!
Всем привет. Сегодня у меня творческая тема, в которой я вам расскажу и поэтапно покажу, что такое рисунки по клеточкам в тетради, они будут легкие и сложные, на разные темы и для разного возраста.
Эти графити в тетрадях подойдут для самых юных школьников, начиная с 7 лет. В основном интерес у детей просыпается в 9-13 лет, первыми начинают девочки, мальчики глядя на них повторяют.
На примере таблицы покажу схему смайлика с вк с подробным описанием работы. В каждой строке указана цифра с буквой, цифра, это число клеток, а буква, это цвет клеточек. К примеру, б обозначает белый цвет, ж – желтый, к – красный, ч – черный.
| Строка | Цифра – число клеточек/ буква — цвет |
| 1 | 11 б, 8 ж |
| 2 | 9 б, 12 ж |
| 3 | 7 б, 16 ж |
| 4 | 6 б, 18 ж |
| 5 | 5 б, 20 ж |
| 6 | 4 б, 22 ж |
| 7 | 3 б, 24 ж |
| 8 | 2 б, 4 ж, 2 к, 3 ж, 2 к, 4 ж, 2 к, 3 ж, 2 к, 4 ж |
| 9 | 2 б, 3 ж, 4 к, 2 ж, 4 к, 1 ж, 4 к, 3 ж |
| 10 | 1 б, 4 ж, 9 к, 2 ж, 9 к, 4 ж |
| 11 | 1 б, 4 ж, 9 к, 2 ж,9 к, 4 ж |
| 12 | 1 б, 5 ж, 7 к, 4 ж, 7 к, 5 ж |
| 13 | 1 б, 6 ж, 5 к, 6 ж, 5 к, 6 ж |
| 14 | 1 б, 7 ж, 3 к, 8 ж, 3 к, 7 ж |
| 15 | 1 б, 28 ж |
| 16 | 1 б, 28 ж |
| 17 | 1, б, 28 ж |
| 18 | 2 б, 26 ж |
| 19 | 2 б, 6 ж, 14 ч, 6 ж |
| 20 | 3 б, 5 ж, 14 ч, 5 ж |
| 21 | 3 б, 6 ж, 12 ч, 6 ж |
| 22 | 4 б, 6 ж, 10 ч, 6 ж |
| 23 | 5 б, 6 ж, 8 ч, 6 ж |
| 24 | 6 б, 18 ж |
| 25 | 7 б, 16 ж |
| 26 | 8 б, 14 ж |
| 27 | 11 б, 8 ж |
По такому принципу можно нарисовать простой рисунок по клеточкам ребенку, либо сложный взрослому.
Самые популярные, это смайлы из вк, новогодние, летние, звери и еда. Транспорт почему — то не пользуется популярностью. Зато машинки, самолеты, и прочее часто используют в графическом диктанте по клеточкам.
Предлагаю ознакомиться со смайликами, которые улыбаются, подмигивают, хохочут, с косичками и в очках.
А это самый радостный смайл с большой улыбкой.
Рисунки по клеточкам в тетради для девочекСреди юных красавиц огромной популярностью пользуются надписи в тетрадях, а именно имена девочек. Но только представьте, если я вам буду показывать схему каждого имени девочки или мальчика, только на букву А, надо написать как минимум 40 имен.
Времени терять я не стану, покажу красивые схемы для начинающих, возможно, они вам и понравятся.
Начну я свою подборку с милого котенка, а точнее с Хелоу Кити, эта милая мордашка является символом моего сайта для всей семьи.
Этот шаблон немного сложнее, сгодится для 10 лет.
Все девочки любят пони, почему бы не нарисовать это маленькое животное в тетради, опираясь на готовый шаблон.
А вот еще один милый котенок в шляпке.
Посмотрите, какие котики могут красоваться в тетрадях в клеточку.
Рисунки по клеточкам в тетради для мальчиковМальчики больше любят рисовать рисунки майнкрафт, но я решила показать вам немного других интересных схем.
Все дети играли или играют в спинер, это такая штука с подшипниками, которая крутится. Ловите мальчики шаблоны этого агрегата.
Для мальчиков 10 лет подойдут андроид по клеточкам, и даже Босс — молокосос.
Свои творения вы можете делать цветными, при отсутствии палитры, выполните рисунок по клеточкам обычным простым карандашом, тогда они у вас получатся черно — белые.
Сложно подобрать самые сложные рисунки, ведь в этом случае надо учитывать возраст художника. Животные по клеточкам относятся к нелегким работам, все объемные тоже попадают под эту категорию.
Для вас я подобрала красивые рисунки по клеточкам в тетради, но при этом сложные и мультяшные.
Такие замечательные Миньоны могут попасть в вашу коллекцию.
Рисунки по клеточкам в тетради – едаНу как обойтись без еды, особенно без фруктов, ведь в них много полезных веществ. Витамины мы кушаем, а вот рисование таких продуктов улучшает мозговую деятельность, развивает память, мышление и моторику пальцев.
Конфета чупа — чупс.
Красивые и сложные клубнички.
Яблочки.
Эскимо на палочке.
Дольки арбузов.
Клубнички.
Киви в разрезе.
Сочная груша.
Вишенки.
Ананас.
Какой выбрать шаблон девочке, мальчику или взрослым, решать вам, все они очень красивые, милые и новые.
Рисунки по клеточкам в тетради – животныеЖивотные бывают маленькие, милые, красивые и большие, именно это все я собрала в одной категории. Сложные рисунки с животными подходят для взрослых, либо детей от 12 лет.
Пингвин.
Панда.
Обезьянка.
Мышонок.
Лисичка.
Кот на луне.
Зайчик.
Гусь.
Бабочка.
Свинья.
Сова.
Божья коровка.
Все шаблоны для срисовывания можно бесплатно скачать.
Рисунки по клеточкам на Новый годЕсли вы ходите выполнить работу в большом формате, тогда вам две клеточки надо брать за одну либо наоборот.
Предлагаю ознакомить с фото и схемами красивых сложных и простых новогодних рисунков для тетрадей.
Снежинки.
Рисунки по клеточкам – летоК лету можно изобразить графический рисунок, как мальчикам, так и девочкам. Для детей 7 – 9 лет выберите легкий и красивый шаблон, к примеру, пальма или мороженое эскимо.
Утка.
Для детей 10 – 12 лет сгодятся более сложные рисунки по клеткам, к примеру, дельфин, солнцезащитные очки.
Рисунки по клеточкам в тетради – цветыШаблоны цветов по клеточкам чаще всего используют девочки или женщины рукодельницы, ведь такие схемы подходят для вышивания и вязания. Вот несколько графических роз.
Друзья, если вы любите рисовать, у вас есть свободное время, попробуйте повторить мои рисунки по клеточкам в тетради, для вас я подробно разобрала один смайлик, показала схемы и шаблоны, поделила все изображения на категории. Если вам трудно справиться со сложными заданиями, начните с рисунка для начинающих, советую даже не смотреть на категорию для девочек или мальчиков, важно, чтобы вам это понравилось.
Подбирала для вас рисунки по клеточкам в тетради Нина Кузьменко.
Детей бывает сложно удивить, но это не означает, что сделать это невозможно. И после целого дня беготни, прыганья, танцев, игр, каждый должен немного успокоиться и заняться чем-то творческим и развивающим. На помощь и приходят маленькие рисунки по клеточкам. Когда нужно занять малышей – вытяните большой лист бумаги в клеточку, чтобы дети могли рисовать вместе.
Конечно, маленькие рисунки по клеточкам в блокноте – также хорошая идея, особенно, когда вы находитесь в пути с ребенком и занять его нечем.
Маленькие и милые они помогут вашему чаду хорошо провести время, они получат от таких занятий максимум пользы. Маленькие рисунки по клеточкам в тетради — простая художественная деятельность, в которой сочетаются искусство и математика.
Леденцы по клеточкам фото
Картошка фри по клеточкам
Котенок по клеткам фото
Не говорите детям много, сделайте сюрприз, возьмите бумагу разного типа, маркеры или цветные карандаши и ручки и позвольте детям приступить к рисованию. Рисунки могут быть произвольными, иногда полезно дать возможность ребенку развить фантазию посредствам рисования. Но можно выбирать и конкретные для 5 лет.
Если у вас есть домашний принтер – тогда вообще здорово. Вы можете настроить и создать собственную графическую бумагу в специальном приложении. У них есть много вариантов для графической бумаги — обычный квадрат, треугольник, и многое другое. Но на этот шаг решайтесь после того, как дети освоят рисование по клеткам. В приложении все же легко выбрать размер формы, которая вам нужна, толщину, цвет линий и многое другое. Тогда макет просто сохраняется их в формате pdf и вы можете распечатать его сразу же.
Используя обычную бумагу в клеточку, можно сделать простые повторяющиеся рисунки, рисунки шахматной доски. Можно объединить квадраты, чтобы делать большие фигуры и разделять квадраты на треугольники и меньшие квадраты и даже на восьмиугольники, чтобы делать всевозможные интересные изображения.
Треугольники и шестиугольники также хорошо подходят для узоров и картин. Для тех, кто уже хорошо справляется с разными фигурами и отлично ориентируется в основах геометрических форм, можно взять за шаблон смайлики из вк. Позвольте ребенку выбрать любимые смайлики и перерисовать их в тетради. Хорошей идеей являются и животные.
Рисовать их первый раз может быть не так просто, если использовать клеточки, но на самом деле, дети быстро подхватят эту идею и уже спустя какое-то время смогут воплощать на листе в клеточку самые смелые идеи.
Несмотря на то, что это простая идея, она дает много пространства для творчества, что с большим количеством случайных математических понятий дает большой бонусный плюс для развития ребенка.
Арбуз по клеткам фото
Миньоны по клеткам фото
Супергерои по клеткам
Котик аниме по клеткам
Стоит отметить, что задания с графической бумагой популярны в детских садиках. Один из распространенных приемов – создание рисунка без образца. Это своеобразный графический диктант. Такое задание легко воспроизвести дома со своим ребенком. Для этого упражнения мы будем использовать листы бумаги формата 4×4. Начиная с левого верхнего угла, мы будем начинать закрашивать квадратики с помощью простых инструкций. Эти инструкции включают:
Выберите простой рисунок, такой как шахматная доска, который будет использоваться в качестве примера. Это хороший способ ввести все символы в ключ. Чтобы начать, заполните график для ребенка — квадрат к квадрату — затем попросите его помочь описать, что вы только что сделали. Во-первых, вы можете говорить алгоритм вслух, тогда вы можете превратить свои словесные инструкции в программу. Пример алгоритма: «Переместить вправо, заполнить квадрат, двигаться вправо, сдвигаемся вниз. Заполнить квадрат, переместиться влево, переместиться влево, заполнить квадрат».
Если ребенок хорошо справляется с этим упражнением, то это повод придумать альтернативное задает с похожей сутью, но сложнее. Если есть еще непонимание, сохраните это задание и попробуйте повторить это на следующий день, а пока поработайте с другим примером.
Если ребенок понимает алгоритм и может определить правильные символы для каждого шага, он готов двигаться дальше.
В зависимости от вашего ребенка, его возраста и развития вы можете либо попытаться сделать сложную сетку вместе, либо перейти к тому, чтобы ребенок работал в паре с другом. Им понравится играть вместе, давая друг другу такие задания. Это отличный способ заставить ребенка работать творчески, придумывая собственные веселые картинки и разбивая их на алгоритмы передвижения по клеткам и их заполнения.
Если ещё морально ребёнка можно подготовить к большим переменам, по средствам общения со сверстниками во дворе и детском саду. То научить малыша быть более внимательным, развить навыки письма, внимательное выполнение неких заданий, можно с помощью графических диктантов и рисования по клеточкам. На сегодняшний день это невероятно популярное занятие, завоевало сердца не только дошколят, но и подростков. Это способ научить малыша письму, развить логику, абстрактное мышление, усидчивость и кропотливость, а так же мелкую моторику ручек. С помощью этого занятия ребёнок развивает координацию, устойчивость и корректирует правильность своих движений, так сказать, «набивает твёрдую руку», что, несомненно, поможет ему в школе, при написании диктантов и конспектов за короткий период времени.
Что такое графические диктанты? Представьте перед собой лист бумаги, на котором расчерчены клеточки. В задании указаны стрелочки (показывающие направление) и цифры (показывающее количество клеток, которые нужно пройти в указанном направлении). Если следовать указателям точно и внимательно, вести черту в нужном направлении на нужное расстояние, получается изображение – картинка.
Иными словами: графические диктанты это рисование по клеточкам, пользуясь указателями в задании.
Такие занятия рекомендуются не только деткам дошкольного возраста, в детских садах, но ребятам до 12-летнего возраста. Ведь внимательность и координацию движений, можно развивать и в старшем возрасте. Увлекательное занятие является занимательным досугом не только для детей, но и взрослых. Рекомендуемый возраст для начала рисования графических диктантов – от 4 лет. Именно в этом возрасте начинают развитие мелкой моторики, с помощью рисования по клеточкам.
Графические диктанты в качестве развивающей игры используют в различных местах: дома, на дополнительных занятиях, на отдыхе, на море, на даче, и даже в летнем лагере. Деток важно заинтересовывать, а что сделает это лучше, чем такое занятие. Ведь в итоге получится неизвестная картинка, которую потом можно разрисовать карандашами или фломастерами. Объясняя малышу это, можно не волноваться за его заинтересованностью этим, не так занятием, как игрой, развивающей воображение.
Итак – начнём выполнение. В первую очередь нужно подготовиться, а именно приобрести сборник графических диктантов. Обзавестись ими можно не только в специализированных магазинах детских книг, но и в лавке с канцелярскими товарами, букинистических магазинах. Бесплатно их можно скачать на некоторых сайтах в интернете (например на нашем сайте), можно зайти и на платные сайты. Выбор таких заданий велик, выбирайте, исходя из возраста, пола и хобби ребёнка. Для малышей, только начинающих занятия, лучше всего подобрать графические диктанты (рисование по клеточкам) с изображением зайчиков, котиков, собачек. Для девочек: принцесс, цветов. Но, можно начать и с простых геометрических фигур: квадратов, треугольников, призм. Так вы сразу обучите ребёнка и координации движений, улучшите моторику ручек, разовьёте усидчивость и внимательность, и расскажите о названиях и видах геометрических фигур. Для мальчиков подойдут диктанты с изображением машинок, животных, роботов, замков, смешных человечков.
Самые легкие графические диктанты, с простыми фигурами и выполняющиеся одним цветов – для начинающих. Усложненные задания – для детей старшего возраста. Выбирайте графические диктанты на тему интересную вашему ребенку. Если малыш занимается музыкой, используйте рисунки музыкальных инструментов, скрипичных ключей и нот.
Если вы уже занимались с ребёнком рисованием по клеточкам, начинайте вносить разнообразие в ваши занятия. То есть, в 5-6 лет, можно выполнять диктанты, помогающие развиваться ещё больше. То есть, приобретайте рисунки с теми животными, которых ребёнок ещё не видел и не знает, как они выглядят. Пользуйтесь цветами, которых малыш ещё не очень хорошо выучил. Расширяйте кругозор ребёнка таким способом, пусть он увеличивает и пополняет свой словарный запас новыми словами, учит их, узнаёт, где их можно применять. Главное, это хорошее настроение, увлечённость и позитивный настрой крохи перед выполнением любого задания. При таких условиях, учёба будет и правда невероятно полезной, плодотворной и не напрягающей ребёнка.
После подборки графических диктантов приступайте к подготовке. Помните, что ребенка нужно обязательно хвалить за удачно выполненную работу. Даже если картинка ещё не получается, не нужно постоянно подсказывать, направлять и сравнивать с другими детьми. Необходимо направлять и немножечко подталкивать в нужном направлении. Для этого в первую очередь, нужно обучить ребенка, где находиться левая сторона, где правая. Покажите где на листочке верх, а где низ. Эти простые и бесхитростные знания, помогут выполнять с точностью до 100% все графические диктанты.
Сядьте возле стола, с ровной и гладкой поверхностью, чтобы ребёнок мог ровно и правильно присесть на стуле. Обратите внимание на освещение. Совет: если вы хотите приучить ребёнка к школьной тетради, дать ему возможность привыкнуть к ней, научиться ориентироваться, подготовьте графические диктанты на листе, точь-в-точь как школьная тетрадка. Теперь приготовьте простой карандаш и старательную резинку, чтобы неправильны полоски можно было легко удалить и продолжить тот же диктант заново.
Себе так же подготовьте карандаш и ластик.
Стоит следить за временем, чтобы ребёнку не надоело, чтобы ручки и глаза отдохнули. Хотя если малыш не устал, хочет продолжить и закончить работу сейчас, не нужно забирать диктант, ребёнок сам решит, когда достаточно.
Существуют временные рамки работы с графическими диктантамиДля деток 5-летнего возраста – максимум 15 минут. Для детей старшего возраста, до 6 лет – максимум 20 минут (от 15 минут). Для первоклашек (6 или 7 лет) – максимум 30 минут, минимум – 20 минут.
Рисование по клеточкам – отличный способ приучить малыша к карандашу и ручке. Научить правильно её держать, практиковаться, чтобы пальчики не так сильно уставали от держания предмета в школе. Данное упражнение поможет вам обучить малыша правильно считать, поскольку ему потребуется отсчитать точное количество клеточек, прежде чем начать занятие.
И так: перед вами лежит задание графического диктанта, карандаш. Перед ребёнком листок в клетку или тетрадь, ластик и простой карандаш. На листе у ребёнка, с вашей помощью или без неё, изображена в указанном месте, точка отсчёта. Объясните, что с этой точки начинают рисовать линии (вправо, влево, вниз и вверх), в том направлении и с тем количеством клеток, которое вы назовёте. Теперь приступайте, возле названного задания, а они указаны в строчку, ставьте точку карандашом, чтобы не забыть на чём вы закончили диктовку, не запутать ребёнка и, конечно же, себя. Следите за тем, что делает ребёнок. Подсказывайте, если малыш путается, где левая и правая сторона. Считайте вместе, если понадобиться, количество клеток.
Например, у вас фигура, самая стандартная – дом. Расскажите малышу, какой рисунок в итоге получится, или сохраните это в тайне для ещё большего интереса. От точки нужно:
1 → — 1 клетка вправо
Диктуйте чётко, ребёнок должен воспринимать всё на слух. В конце работы посмотрите, насколько фигуры малыша, совпадают с заданными элементами. Если малыш ошибся, выясните вместе, где именно.
Ластиком сотрите лишние линии, начиная с точки сбоя, и продолжайте черчение. Важно в процессе учебы сохранить хорошее настроение ребёнка.
Все мы художники в душе. И всем нам хочется свой мир разукрасить. А потому рисунки по клеточкам в тетради могут нам в этом помочь. С ними легко можно выполнить сложные и простые рисунки. Понять, как нарисовать сердце по клеточкам, или же, еду, цветы, игривую маму-кошку и ее забияку котенка. А хотите, у вас могут получиться и портреты? Например, есть такие рисунки по клеточкам, фото которых напоминают и изображения людей: мальчика и девочку, все эти разные рисунки несложно освоить.
Чтобы понять, как рисовать по клеточкам цветные красивые картинки, стоит познакомиться с техникой нанесения узора по номерам. Увидеть, что есть разные схемы и все они очень легкие, доступные даже новичкам. Ими можно быстро овладеть. Ведь для каждого из нас по небольшим частям воспроизвести нарисованных зверушек, смайлы и сердечки будет не сложно.
И все же, какие есть маленькие и большие, цветные и черно-белые рисунки, выполненные так, чтобы их легко было повторить; и какие перспективы овладеть этой техникой:
Для каких бы целей ни служили наши подсказки, например, если это – картинки по клеточкам для девочек 12 лет или рисунки с аппетитной едой, все их можно использовать, чтобы отточить свои художественные способности.Не только образцы готовых открыток у нас есть, но и рисунки по клеточкам: схемы. Такая подсказка, как готовая инструкция поможет двигаться четко по плану, а может быть и в своей, привычной, любимой манере выполнить работу любой сложности. Например, сделать рисунок мороженого по клеточкам, или животных, того же самого котика, или целые композиционные иллюстрации для личного дневника.
Не только для давних друзей нашего развлекательного ресурса предоставляется такая возможность, но и новые гости тоже получат шанс обучиться этому искусству, они имеют возможность взять своеобразный мастер класс, урок по изображению всевозможных картинок, на любой вкус и разной сложности.
Специально, для всех деток, кто любит мультфильм про милых пони и их дружбу, мы подготовили сюрприз! У нас есть картинки по клеточкам пони. Яркие, красочные, они очень привлекательные для деток. А потому мы предлагаем схему, как нарисовать пони по клеточкам. Эта и подобные «инструкции» достаточно понятные и лёгкие даже для ребенка. А главное, они интересные для малышей.
Отдельная категория – это рисунки по клеточкам смайлики. Они всегда интересны и всегда актуальны. Они передают настроение и их просто повторить. Для взрослых и детей такая тема именно то, что может подарить радость от плодотворного труда.
Удивительно, как часто подобные картинки для выручают нас. Благодаря им можно прекрасно провести время с ребеночком, сколько бы ему не было лет, 5,7 или только год. Мы можем в блокноте делать наброски на скучных совещаниях или в дороге занять себя. А картинки по клеточкам для личного дневника – это вообще незаменимая вещь. А потому, везде и при любых случаях скачивайте или сами нарисуете милые иллюстрации.
.. Видели, как увлечённо ваши одноклассники создают рисунки по клеточкам Майнкрафт? Немного усидчивости, фантазии и на бумаге появляется новый герой игры, заполнен… Играть в развивающие компьютерные игры, такие как Майкрафт – это очень интересно. Дети могут часами просиживать в ней. Никто не откажется от возможности поискат…Плодовые мушки (Drosophila melanogaster) обычно откладывают яйца в перезрелые фрукты и ягоды, которые люди, как правило, не используют. Однако, как показано в недавнем исследовании, если у мушек ослабляется восприятие горького вкуса, то они начинают поражать плоды на более ранних сроках созревания. Возможно, именно такое изменение вкусовой чувствительности когда-то стало толчком для запуска эволюционных преобразований у дрозофилы D. suzukii — опасного вредителя, наносящего урон сельскохозяйственным культурам и активно распространяющегося по всему миру.
Всем известная плодовая мушка (Drosophila melanogaster) — излюбленный модельный вид биологов и генетиков, один из самых изученных видов животных, своим служением науке принесший огромную пользу человечеству (см., например, Составлена самая подробная карта экспрессии генов в эмбрионе дрозофилы, «Элементы», 16.10.2017). Ее близкий родственник D. suzukii (рис. 1), наоборот, заслужил дурную славу: эта маленькая мушка представляет серьезную угрозу для некоторых важных плодово-ягодных культур — клубники, ежевики, черешни, винограда. Как и у других видов дрозофил, ее личинки развиваются в плодах растений, однако для откладывания яиц D. suzukii выбирает не подгнивший субстрат, а спелые и даже недоспелые плоды (M. Karageorgi et al., 2017. Evolution of Multiple Sensory Systems Drives Novel Egg-Laying Behavior in the Fruit Pest Drosophila suzukii). Вылупляющиеся через несколько дней личинки питаются свежими соками ягод, подчас не оставляя шанса полакомиться ими кому-то еще.
Этот вид, изначально обитавший в Восточной Азии, в 2008 году был завезен в Калифорнию (M. Hauser, 2011. A historic account of the invasion of Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae) in the continental United States, with remarks on their identification) и с тех пор быстро захватывает новые регионы, распространяясь в последние годы не только в Северной Америке, но и в Европе.
Наиболее явная и обращающая на себя внимание адаптация D. suzukii, облегчающая откладывание яиц в плоды на ранних сроках созревания, — крупный и зазубренный яйцеклад (рис. 2), напоминающий пилу и легко проникающий через кожицу фруктов и ягод. Другие виды дрозофил по длине яйцеклада значительно уступают D. suzukii. Впрочем, у ее ближайшего родственника D. biarmipes яйцеклад тоже довольно крупный, но этот вид не проявляет особых предпочтений при выборе субстрата, откладывая яйца в ягоды и фрукты на разных стадиях зрелости (J. E. Green et al., 2019. Evolution of Ovipositor Length in Drosophila suzukii Is Driven by Enhanced Cell Size Expansion and Anisotropic Tissue Reorganization).
В предыдущих исследованиях уже было показано, что дрозофилы при выборе места для откладки яиц учитывают твердость субстрата (D. suzukii предпочитает более твердый субстрат по сравнению с другими видами), а также ориентируются на его запах (M. Karageorgi et al., 2017. Evolution of Multiple Sensory Systems Drives Novel Egg-Laying Behavior in the Fruit Pest Drosophila suzukii). В новой работе, опубликованной в журнале eLife, американским ученым удалось продемонстрировать, что на поведение дрозофил влияют и вкусовые качества субстрата — в частности, концентрация в нем горьких веществ.
Многие растения защищают свои плоды от вредителей, стремящихся полакомиться ими раньше времени, разнообразными горькими на вкус токсинами. В недозрелых фруктах и ягодах ряд горьких компонентов присутствует в более высокой концентрации, чем в перезрелых (A.
P. Lopes et al., 2020. Quantification of phenolic compounds in ripe and unripe bitter melons (Momordica charantia) and evaluation of the distribution of phenolic compounds in different parts of the fruit by UPLC–MS/MS; G. W. Cheng, P. J. Breen, 1991. Activity of Phenylalanine Ammonia-Lyase (PAL) and Concentrations of Anthocyanins and Phenolics in Developing Strawberry Fruit). Поэтому авторы обсуждаемой работы предположили, что дрозофилы D. melanogaster определяют «привлекательность» плодов, в том числе, и по их горечи, стараясь не откладывать яйца в более горький субстрат.
Чтобы это проверить, ученые на различных уровнях (от поведенческого до молекулярного) исследовали рецепцию горького вкуса у D. suzukii и ее родственников. В опытах были задействованы два уже упоминавшихся вида мушек — D. melanogaster и D. biarmipes (этот вид филогенетически ближе к D. suzukii, а по ряду параметров — например, по размеру яйцеклада и тактике выбора субстрата — занимает промежуточное положение между D. suzukii и D. melanogaster), а также мушки D. melanogaster с мутацией гена вкусового рецептора Gr33a, проявляющие сниженную чувствительность к горькому.
На первом этапе исследований были проведены поведенческие тесты, в которых дрозофилам предлагали на выбор несколько субстратов из клубники разной степени спелости.
Собранные на одном участке ягоды клубники были разделены на семь кучек по их зрелости — от твердых бело-зеленых (1 стадия) до полностью ферментированных, гниющих ягод (7 стадия). Ягоды растерли в пюре и поместили в чашки Петри. Сто мушек одного вида (80 самок и 20 самцов) запускали в пластиковую камеру с семью чашками Петри, в каждой из которых находилось клубничное пюре из ягод одной стадии зрелости, а через сутки исследователи подсчитывали, где именно мушки отложили яйца.
Оказалось, что D. melanogaster достоверно чаще выбирали самую последнюю стадию — перезрелые ягоды (рис. 3). А вот D. suzukii предпочитали откладывать яйца пюре из незрелых ягод, а также в пюре из спелых ягод (5 стадия зрелости). У D. biarmipes достоверных предпочтений обнаружено не было.
Затем количество предлагаемых мушкам вариантов сократили до двух — оставили только спелые (5 стадия) и переспелые ягоды (7 стадия). Как и ожидалось, D. suzukii чаще откладывали яйца в пюре «посвежее», а D. melanogaster — в пюре «с гнильцой». Но вот D. melanogaster с мутацией вкусового рецептора Gr33a (хуже ощущающие горечь) повели себя подобно D. suzukii, чаще выбирая для откладывания яиц субстрат из спелых ягод. Такое поведение свидетельствует в пользу того, что дрозофилы ориентируются и на вкус фруктов и ягод, подбирая подходящую среду для кладки.
Разобравшись с поведенческими предпочтениями мушек, ученые описали анатомические отличия органов вкусовой рецепции — вкусовых сенсилл — у дрозофил трех видов, с которыми они работали в обсуждаемом исследовании. У насекомых такие сенсиллы располагаются на верхней губе, на ножках и на яйцекладе (рис. 5). Также рецепторы вкусовой чувствительности есть в глотке и на крыльях, но в данной работе они не рассматривались, так как, по всей видимости, при выборе субстрата для кладки яиц они не играют решающей роли (поскольку не контактируют напрямую с субстратом).
Вкусовые сенсиллы выглядят как волоски с прямой или раздвоенной верхушкой. На кончике волоска обычно есть отверстие (пора). В основании таких волосков лежат тела нескольких чувствительных нейронов. Ранее считалось, что каждый из этих нейронов настроен на восприятие лишь одного вкуса (например, только сладкого или только соленого), но последующие исследования показали, что это не так: один нейрон может реагировать и на горькие, и на соленые вещества (подробнее про хеморецепцию дрозофил можно почитать, например, в статье H. Amrein, 2016. Mechanism of Taste Perception in Drosophila).
Паттерны распределения вкусовых сенсилл на губе оказались сходны у всех трех исследованных видов дрозофил, но у D. melanogaster их там оказалось больше: по 31 штуке с каждой стороны губы, а у двух других видов — по 27 штук. На ножках количество и расположение вкусовых сенсилл совпадало у всех трех видов. У сенсилл на яйцекладе исследуемых видов дрозофил, как оказалось, пор нет. Ученые рассудили, что они не функционируют как органы вкусовой чувствительности.
Исследователи определили, какие из вкусовых сенсилл отвечают за восприятие горького вкуса. Для этого был измерен электрофизиологический ответ каждого чувствительного волоска на различные химические вещества, имеющие горький вкус. В качестве стимулов были выбраны как вещества, встречающиеся в незрелых плодах растений (алкалоиды, терпеноиды, фенольные соединения), так и токсины синтетической природы (диэтилтолуамид). Авторы использовали стандартную методику изучения вкуса у насекомых, подводя к каждой вкусовой сенсилле обездвиженной дрозофилы электрод, одновременно служащий и контейнером для вкусового стимула, и регистратором возбуждаемого электрического сигнала (R. Delventhal et al., 2014. Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla).
Было установлено, что за восприятие горького вкуса ответственны, главным образом, короткие сенсиллы и сенсиллы промежуточной длины. У D. melanogaster таких сенсилл больше, чем у D. suzukii и D. biarmipes. Длинные вкусовые сенсиллы не обладают чувствительностью к исследованным горьким веществам.
Три исследованных вида дрозофил различались по вкусовой чувствительности к разным горьким веществам, но результаты неоднозначны: например, у D. suzukii снижена чувствительность к сапонину и диэтилтолуамиду, зато усилена реакция на аристолохиевую кислоту (по сравнению с двумя другими видами).
Ученые также измерили электрофизиологический ответ сенсилл губы на сложный стимул — сок из спелой клубники и сок из переспелой клубники.
Выяснилось, что сок переспелой клубники вызывает у всех трех видов более сильную реакцию сенсилл, чем сок спелой клубники (рис. 7). Это противоречит исходно принятой гипотезе авторов, согласно которой короткие вкусовые сенсиллы у D. melanogaster, казалось бы, «должны» сильнее реагировать на предположительно более горькие спелые ягоды и слабее — на переспелые.
По всей видимости, механизмы восприятия вкуса и поиска пригодного для откладывания яиц субстрата у дрозофил могут оказаться гораздо сложнее, чем в первоначально принятой модели. Так, помимо рецепции горького, важное значение может иметь и восприятие других вкусов — обратите внимание на усиленный (по сравнению с D. melanogaster) ответ длинных сенсилл у D. suzukii. Кроме того, эволюционные изменения поведения могли происходить и без изменения чувствительности рецепторов.
В еще одной серии экспериментов исследователи добавляли в клубничное пюре определенные химические вещества с горьким вкусом и предлагали мушкам на выбор обычные и горькие субстраты для откладывания в них яиц. Тесты показали, что D. suzukii менее избирательна: добавление в пюре гидрохлорида лобелина или бензоата денатония никак не влияло на ее поведение, в то время как D. biarmipes и D. melanogaster избегали откладывать яйца в такой «горький» субстрат.
Наконец, была изучена экспрессия генов, ответственных за рецепцию горького вкуса. Анализ транскриптома клеток губы дрозофил показал, что некоторые гены семейства вкусовых рецепторов (Gr), отвечающие за определение горького вкуса, экспрессируются у D. suzukii в несколько раз слабее, чем у двух других видов. Экспрессия одного из таких генов, Gr22f, у D. suzukii полностью отсутствовала. Как известно из более ранних работ, у дрозофил этот ген может отвечать за рецепцию бензоата денатония (горького на вкус): мутантные по гену Gr22f особи D. melanogaster частично теряют чувствительность к этому веществу (H. Y. Sung et al., 2017. Heterogeneity in the Drosophila gustatory receptor complexes that detect aversive compounds).
С этой точки зрения было бы очень интересно включить в данное исследование и D. melanogaster, мутантных по гену Gr22f, что авторы работы планируют сделать в будущем. Быть может, именно работа этого гена оказывается одним из ключевых моментов, направляющих поведение дрозофилы при выборе места для откладки яиц.
Обнаруженные в работе анатомические, физиологические, поведенческие и молекулярные особенности рецепции горького вкуса D. suzukii (по сравнению с двумя другими видами дрозофил), в целом, говорят о сниженной чувствительности к горькому вкусу у этого вида. Интересно, что потеря такой чувствительности уже сама по себе может привести к изменению стратегии поведения мушек, что и продемонстрировали мутанты D. melanogaster по гену Gr33a, выбравшие для кладки нехарактерные для вида субстраты. Не исключено, что редукция горького вкуса когда-то стала одной из важных причин, направивших эволюцию D. suzukii по пути «вредительства».
Впрочем, нужно подчеркнуть, что это всего лишь предположение; скорее всего, частичная потеря горькой рецепции проходила совместно с изменением других вкусовых предпочтений. Кроме того, чувствительность к определенным вкусам не обязательно должна диктовать выбор места для кладки: так, у D. suzukii не потеряна рецепция к лобелину, однако добавление этого горького вещества в среду никак не влияет на репродуктивное поведение D. suzukii (в отличие от других видов).
У других видов дрозофил освоение новых экологических ниш происходило несколько иначе: они пошли по пути специализации и адаптировались к конкретным видам растений. Так, D. sechellia откладывает яйца в токсичные для других дрозофил плоды нони (Morinda citrifolia), а D. erecta — в плоды панданов (Pandanus spp.). Оба этих вида имеют «каноническое» число вкусовых сенсилл, хотя D. sechellia, возможно, также обладает ослабленной чувствительностью к горечи: как и у D. suzukii, у нее снижена экспрессия ряда генов горькой рецепции семейства Gr.
Отметим, что по итогам обсуждаемой работы остаются вопросы — очевидно, что крайне желательно было бы провести химический анализ используемого в опытах клубничного сока. Не исключено, что многие из «чистых» горьких веществ, для которых проведено тестирование чувствительности сенсилл, в нем попросту отсутствуют, а на выбор дрозофил влияют другие, неучтенные компоненты. Будем надеяться, что в дальнейших исследованиях ученые разберутся и с этим.
Источник: Hany K. M. Dweck, Gaëlle J. S. Talross, Wanyue Wang, John R. Carlson. Evolutionary shifts in taste coding in the fruit pest Drosophila suzukii // eLife. 2021. DOI: 10.7554/eLife.64317.
Анастасия Вабищевич
К концу этого раздела вы сможете:
Клетки делятся на две большие категории: прокариотические и эукариотические. Преимущественно одноклеточные организмы из доменов Бактерии и Археи классифицируются как прокариоты ( pro — = ранее; — karyon — = ядро).Клетки животных, клетки растений, грибы и простейшие являются эукариотами ( eu — = верно).
Все клетки имеют четыре общих компонента: 1) плазматическую мембрану, внешнее покрытие, отделяющее внутреннюю часть клетки от окружающей среды; 2) цитоплазма, состоящая из желеобразной области внутри клетки, в которой находятся другие клеточные компоненты; 3) ДНК, генетический материал клетки; и 4) рибосомы, частицы, синтезирующие белки. Однако прокариоты несколько отличаются от эукариотических клеток.
Прокариотическая клетка — это простой одноклеточный (одноклеточный) организм, у которого отсутствует ядро или любая другая мембраносвязанная органелла . Вскоре мы увидим, что у эукариот это значительно отличается. Прокариотическая ДНК находится в центральной части клетки: затемненной области, называемой нуклеоидом.
Рисунок 3.6. На этом рисунке показана обобщенная структура прокариотической клетки.В отличие от архей и эукариот, бактерии имеют клеточную стенку из пептидогликана, состоящую из сахаров и аминокислот, а многие из них имеют полисахаридную капсулу (рис.6). Клеточная стенка действует как дополнительный слой защиты, помогает клетке сохранять свою форму и предотвращает обезвоживание. Капсула позволяет клетке прикрепляться к поверхностям в окружающей среде. У некоторых прокариот есть жгутики, пили или фимбрии. Жгутики используются для передвижения, в то время как большинство пилей используются для обмена генетическим материалом во время типа воспроизводства, называемого конъюгацией.
В природе взаимосвязь между формой и функцией очевидна на всех уровнях, включая уровень клетки, и это станет ясно, когда мы исследуем эукариотические клетки.Принцип «форма следует за функцией» встречается во многих контекстах. Например, птицы и рыбы имеют обтекаемые формы тела, которые позволяют им быстро перемещаться в среде, в которой они живут, будь то воздух или вода. Это означает, что, в общем, можно вывести функцию структуры, глядя на ее форму, потому что они совпадают.
Эукариотическая клетка — это клетка, которая имеет связанное с мембраной ядро и другие мембраносвязанные компартменты или мешочки, называемые органеллами , которые имеют специализированные функции.Слово эукариотическое означает «истинное ядро» или «истинное ядро», имея в виду присутствие в этих клетках связанного с мембраной ядра. Слово «органелла» означает «маленький орган», и, как уже упоминалось, органеллы обладают специализированными клеточными функциями, так же как органы вашего тела имеют специализированные функции.
При диаметре 0,1–5,0 мкм прокариотические клетки значительно меньше эукариотических клеток, диаметр которых варьируется от 10 до 100 мкм (рис. 3.7). Небольшой размер прокариот позволяет ионам и органическим молекулам, которые входят в них, быстро распространяться в другие части клетки.Точно так же любые отходы, образующиеся в прокариотической клетке, могут быстро уйти. Однако более крупные эукариотические клетки развили различные структурные адаптации для улучшения клеточного транспорта. Действительно, большой размер этих клеток был бы невозможен без этих приспособлений. В общем, размер ячейки ограничен , потому что объем увеличивается намного быстрее, чем площадь поверхности ячейки. По мере того, как ячейка становится больше, ячейке становится все труднее и труднее получать достаточное количество материалов для поддержки процессов внутри ячейки, потому что относительный размер площади поверхности, через которую должны транспортироваться материалы, уменьшается.
Рисунок 3.7 На этом рисунке показаны относительные размеры различных типов ячеек и клеточных компонентов. Взрослый человек показан для сравнения.Прокариоты — это преимущественно одноклеточные организмы из доменов Бактерии и Археи. Все прокариоты имеют плазматические мембраны, цитоплазму, рибосомы, клеточную стенку, ДНК и не имеют мембраносвязанных органелл. У многих также есть полисахаридные капсулы. Прокариотические клетки имеют диаметр от 0,1 до 5,0 мкм.
Подобно прокариотической клетке, эукариотическая клетка имеет плазматическую мембрану, цитоплазму и рибосомы, но эукариотическая клетка обычно больше прокариотической клетки, имеет истинное ядро (то есть ее ДНК окружена мембраной) и имеет другую мембрану. -связанные органеллы, которые позволяют разделить функции.Эукариотические клетки обычно в 10-100 раз больше прокариотических клеток.
эукариотическая клетка: клетка, имеющая мембраносвязанное ядро и несколько других мембраносвязанных компартментов или мешочков
органелла: мембраносвязанный отсек или мешок внутри клетки
прокариотическая клетка: одноклеточный организм, не имеющий ядра или любой другой мембраносвязанной органеллы
Обнаружение и сегментация клеток макрофагов на изображениях флуоресцентной микроскопии представляет собой сложную проблему, в основном из-за скопления клеток, различий в форме и морфологической сложности.Мы представляем новый подход глубокого обучения для обнаружения и сегментации клеток, который включает ранее изученные функции ядра. Новое сочетание пирамид признаков для обнаружения и сегментации ядер с пирамидами признаков для обнаружения и сегментации клеток используется для повышения производительности набора данных микроскопических изображений, созданного нами и предоставленного для всеобщего использования, содержащего как ядра, так и сигналы клеток. Наши экспериментальные результаты показывают, что обнаружение и сегментация клеток значительно выигрывают от слияния ранее изученных характеристик ядра.Предлагаемая архитектура слияния пирамид функций явно превосходит современный подход Mask R-CNN для обнаружения и сегментации ячеек с улучшением относительной средней средней точности до 23,88% и 23,17% соответственно.
Для анализа клеточной инфекции и изменений в морфологии клеток на изображениях флуоресцентной микроскопии необходимы надлежащее обнаружение и сегментация клеток. При автоматизированном анализе изображений флуоресцентной микроскопии разделение сигналов в непосредственной близости является сложной задачей.Высокая плотность клеток или кластерные образования увеличивают вероятность таких ситуаций на клеточном уровне. Другое ограничение — обнаружение морфологически сложных клеток, таких как макрофаги или нейроны. Их неопределенная морфология вызывает проблемы с идентификацией при поиске небольших вариаций фиксированных форм. По сравнению с простым сегментированием цитоплазмы сегментация на основе экземпляров представляет собой гораздо более сложную задачу, поскольку требуется присвоение идентификатора экземпляра клетки каждому пикселю изображения.Мы представляем новый подход глубокого обучения для обнаружения и сегментации клеток, который эффективно использует канал ядра для улучшения сегментации и обнаружения клеток за счет включения ранее изученных функций ядра. Это достигается за счет слияния пирамид признаков для обнаружения и сегментации ядра. Эффективность оценивается на наборе данных микроскопических изображений, содержащих сигналы как ядра, так и клеток.
Образец цитирования: Korfhage N, Mühling M, Ringshandl S, Becker A, Schmeck B, Freisleben B (2020) Обнаружение и сегментация морфологически сложных эукариотических клеток на изображениях флуоресцентной микроскопии с помощью слияния пирамид признаков.PLoS Comput Biol 16 (9): e1008179. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008179
Редактор: Дина Шнайдман-Духовны, Еврейский университет Иерусалима, ИЗРАИЛЬ
Поступила: 11.10.2019; Принят в печать: 22 июля 2020 г .; Опубликовано: 8 сентября 2020 г.
Авторские права: © 2020 Korfhage et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Доступность данных: Набор данных доступен по адресу https://box.uni-marburg.de/index.php/s/N934NJi7IsvOphf. Код и модели доступны по адресу https://github.com/umr-ds/feature_pyramid_fusion.
Финансирование: Эта работа была поддержана HMWK (Исследовательский центр LOEWE SYNMIKRO и его исследовательский центр «Технологии скрининга и автоматизации», Исследовательский кластер LOEWE MOSLA и Исследовательский кластер LOEWE Medical RNomics), DFG (SFB / TR- 84 TP C01) и BMBF (например, Med CAPSYS, JPI-AMR, ERACoSysMed2 — SysMed-COPD).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
Это статья о программном обеспечении PLOS по вычислительной биологии .
Высокопроизводительная клеточная биология включает в себя такие методы, как анализ микроскопических изображений, микроматрицы экспрессии генов или полногеномный скрининг для решения биологических вопросов, которые иначе невозможно решить с помощью более традиционных методов [1].
Тем не менее, флуоресцентной микроскопии часто избегают в экспериментах с высокой пропускной способностью, поскольку полученные данные утомительно для анализа людьми или слишком сложны для анализа с использованием доступных инструментов обработки изображений. Однако флуоресцентная микроскопия дает информацию о субклеточной локализации, поддерживает морфологический анализ и позволяет проводить исследования на уровне отдельных клеток [2].
Ограничивающим фактором автоматического анализа изображений с помощью флуоресцентной микроскопии является разделение сигналов в непосредственной близости, независимо от того, исходят ли сигналы от соседних клеток или отдельных пятен.Высокая плотность клеток или образование кластеров увеличивают вероятность таких ситуаций на клеточном уровне [3], в то время как высокий фон или низкое пространственное разрешение усложняют проблему на уровне сигнала. Другое ограничение — обнаружение морфологически сложных клеток, таких как макрофаги или нейроны. Их неопределенная морфология вызывает проблемы с идентификацией при поиске небольших вариаций фиксированных форм.
Изображения флуоресцентной микроскопии, рассматриваемые в этой статье, получены в результате высокопроизводительного скрининга с целью анализа фенотипических изменений и различий в уровне бактериальной инфекции макрофагов после лечения.Чтобы проанализировать клеточную инфекцию и изменения в морфологии клеток, необходимо надлежащее обнаружение и сегментация клеток. При адгезии к поверхности эти клетки имеют тенденцию образовывать кластеры, демонстрирующие слабые изменения сигнала в областях, прилегающих к контакту клетки с клеткой. Эти ограничения препятствуют проведению надлежащего анализа с помощью обычного программного обеспечения для анализа микроскопии.
По сравнению с простым сегментированием цитоплазмы, сегментация на основе экземпляров является гораздо более сложной задачей, поскольку требуется присвоение идентификатора экземпляра клетки каждому пикселю изображения.Рис. 1 показывает, что точное разделение и сегментация сгруппированных ячеек без какой-либо дополнительной информации чрезвычайно сложно, если вообще возможно. Даже для специалистов-людей правильное разделение отдельных клеток часто возможно только с использованием информации о ядре. Рис. 1 показывает, что учет сигнала ядра значительно облегчает идентификацию отдельных клеток.
В этой статье подход глубокого обучения к обнаружению и сегментации клеток, основанный на архитектуре сверточной нейронной сети (CNN), применяется к изображениям флуоресцентной микроскопии, содержащим каналы для ядер и клеток.Вклады статьи следующие:
Наш подход связан с несколькими подходами к сегментации экземпляров для изображений флуоресцентной микроскопии.Методы, не основанные на глубоком обучении, такие как алгоритмы вырезания графов [5–9], обычно борются с морфологически сложными объектами. Точно так же другие методы либо рассматривают ядра [5, 10, 11], либо сегментируют объекты аналогичного размера и в основном круглые [12] или различной формы [13, 14]. В частности, все эти методы рассматривают только один сигнал, будь то клетка или ядро. Метод, использующий информацию ядра вместе с клеточным сигналом, описан Held et al. [15] и Wenzel et al. [16]. Их алгоритм сегментации использует набор быстроходных уровней [17], т.е.е., классический метод компьютерного зрения, не основанный на методах машинного обучения. Более поздний подход, предложенный Аль-Кофахи и др. [18] уточняет сегментацию ядра на основе глубокого обучения с помощью алгоритма засеянного водораздела для сегментации клеток.
Последние алгоритмы сегментации на основе CNN можно условно разделить на две группы. Алгоритмы первой группы выполняют полную сегментацию изображения и требуют дополнительной постобработки для применения к сегментации экземпляров [19–21]. Хорошо известным примером биомедицинской сегментации изображений является архитектура U-Net [22].Однако такие методы не работают в случае кластерных ячеек. Из-за небольшого количества неправильно классифицированных пикселей соседние ячейки объединяются в одну ячейку, что снижает производительность обнаружения.
По этой причине мы считаем методы второй группы алгоритмов сегментации на основе CNN более подходящими для наших данных. Эти методы выполняют обнаружение с последующей сегментацией, т. Е. Обнаруженные ограничивающие рамки сегментируются, а не все изображение. Например, ван Вален и др. [23] используют обнаружение объектов и на следующем этапе выполняют сегментацию ограничивающей рамки.Akram et al. [24] описывают архитектуру CNN с использованием объединения областей интересов (RoI) для обнаружения ячеек и сегментации на основе экземпляров. Недавно Mask R-CNN [4], основанная на Faster R-CNN [25] с пирамидами признаков [26], достигла самых современных результатов в обнаружении и сегментации объектов естественного изображения. Следовательно, наш подход к обнаружению и сегментации ядер и клеток основан на Mask R-CNN. Однако, в отличие от недавних работ по применению Mask R-CNN для решения ряда проблем сегментации в биомедицинской визуализации, включая сегментацию ядра [27–29], мы расширяем архитектуру для удовлетворения требований наборов данных, содержащих как сигналы клеток, так и ядра.
Изображения флуоресцентной микроскопии, используемые в нашей работе, собираются в рамках высокопроизводительного скрининга для выявления методов лечения, которые влияют на бактерию Legionella pneumophila и модифицируют инфекцию макрофагов человека. Микроскопические изображения не только позволяют оценить размножение бактерий, но также позволяют исследовать морфологические изменения.
Моноцитарные клетки THP-1 получали из АТСС, инокулировали из культуры при -80 ° C и пассировали в среде RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой (Biochrom) при 37 ° C и 5% CO 2 .Число использованных пассажей клеток находилось в диапазоне от 5 до 14. Клетки высевали в 100 мкл мкл на 96-луночные планшеты Sensoplate Plus (Greiner Bio-One) в концентрации 1,45 × 10 4 клеток на лунку. Дифференцировку макрофагов индуцировали через 24 часа после посева путем добавления 20 нМ форбол 12-миристат 13-ацетата (PMA; Sigma-Aldrich) на 24 часа. После обновления среды клетки инфицировали GFP-экспрессирующим Legionella pneumophila штамма Corby при множественности инфицирования 20 в течение 16 часов.Для заражения бактерии высевали на агар BCYE, инкубировали в течение 3 дней при 37 ° C и 5% CO 2 , ресуспендировали и добавляли к макрофагам [30]. После заражения клетки промывали, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 минут и повышали проницаемость с помощью 0,1% Triton X-100 в течение 10 минут. Окрашивание клеток достигали с помощью HCS CellMask Red (2 μ г / мл; Thermo Fisher Scientific) и Hoechst 33342 (2 μ г / мл; Invitrogen) в течение 30 мин.
Изображения были получены с помощью автоматического флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E с объективом 20x (Nikon CFI Plan Apo VC 20X) и камеры Nikon Digital Sight DS-Qi1Mc.Наконец, изображения были преобразованы в формат TIFF с помощью плагина Fiji / ImageJ Bio-Formats.
Всего было собрано несколько сотен тысяч трехканальных изображений размером 1280 × 1024 пикселей.
Для нашего эталонного набора данных было отобрано 82 репрезентативных изображения, дополненных достоверной информацией биомедицинским исследователем. В нашей работе интерес представляют только ядро и клеточные каналы.
Эти 82 двухканальных изображения были случайным образом разделены на обучающий набор, содержащий 64 изображения, и тестовый набор, содержащий 18 изображений.В то время как обучающий набор содержит 2044 клетки и 2081 ядро, тестовый набор содержит 508 клеток и 514 ядер. Несоответствие между количеством экземпляров клеток и ядер связано с тем, что пограничные клетки не полностью видны на изображениях. Кроме того, некоторые клетки находятся в своей митотической фазе, то есть в одной клетке может встречаться несколько ядер.
Создание наземных меток для задач сегментации вручную занимает очень много времени. Поэтому мы сгенерировали основные маски сегментации для экземпляров клеток и ядер в двухэтапном процессе.На первом этапе были применены классические алгоритмы компьютерного зрения для создания начальной сегментации с использованием подхода на основе порогов и функций обработки контуров из библиотеки OpenCV [31] для поиска экземпляров клеток и ядер. Кроме того, структуры этих экземпляров были проанализированы, и клетки с более чем одним ядром были разделены аналогично сегментации Вороного, где каждый пиксель клетки привязан к ближайшему ядру. На втором этапе эти сегменты были уточнены вручную с помощью инструмента обработки изображений, разработанного для научных многомерных изображений, под названием Fiji / ImageJ [32].Большинство наших ручных исправлений были необходимы от ячейки до границ ячеек.
Чтобы сегментировать клетки макрофагов, мы следуем подходу сегментации на основе экземпляров, вводя новую архитектуру нейронной сети, основанную на Mask R-CNN. Он сочетает в себе особенности ядра и клетки в схеме слияния пирамиды. Архитектура Mask R-CNN [4] является расширением Faster R-CNN [25], которое предсказывает ограничивающие рамки с вероятностями классов и дополнительными масками сегментации на основе экземпляров.
Подобно Faster R-CNN, Mask R-CNN является двухэтапным методом.На первом этапе сеть предложений регионов (RPN) используется для поиска предложений по объектам (интересующие регионы, RoI). Таким образом, прогнозируются ограничивающие рамки кандидатов вместе с оценками объектности. На втором этапе для этих возможных ограничивающих рамок извлекаются признаки с помощью слоя RoI Align, который вычисляет карты признаков фиксированного размера посредством билинейной интерполяции. На основе этих карт характеристик возможные ограничивающие рамки уточняются, классифицируются и сегментируются с использованием соответственно регрессии, классификации и сегментирования.Функции двух этапов являются общими в базовой архитектуре для улучшения времени выполнения. Архитектура магистрали CNN обычно предварительно обучается задаче классификации изображений. Общая нейронная сеть настраивается и обучается от начала до конца с использованием многозадачных потерь L = L box + L cls + L mask , где L box — потери регрессии ограничивающего прямоугольника, L cls — потери классификации, а L mask — потери маски (т.е.е., на пиксельный сигмоид с двоичными потерями) соответственно.
Для повышения производительности обнаружения и сегментации в областях небольших объектов, Mask R-CNN использует сеть пирамид функций (FPN) [26], нисходящую архитектуру с боковыми подключениями к магистральным слоям для построения высокоуровневых семантических карт признаков на все весы. Карты функций для регрессии, классификации и сегментации ограничивающих прямоугольников-кандидатов извлекаются из уровня пирамиды в соответствии с размерами ограничивающего прямоугольника. Ограничительные рамки большего размера назначаются более высоким уровням пирамиды, а прямоугольники меньшего размера — более низким уровням, соответственно.На рис. 2 базовая архитектура Mask R-CNN выделена зеленым.
Рис. 2. Пирамида признаков слияния признаков ядра.
Предварительно обученные признаки ядра (фиолетовый) объединяются с признаками пирамиды признаков в модели обнаружения и сегментации клеток (зеленый) либо путем конкатенации, либо сложения.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008179.g002
Остальная часть этого раздела организована следующим образом. Сначала мы опишем используемую магистральную CNN.Затем представлена новая сетевая архитектура, использующая схему слияния пирамид для интеграции функций ядра для обнаружения и сегментации клеток.
Кроме того, вводится взвешенная потеря сегментации, чтобы сфокусировать процесс обучения на трудных для сегментации пикселях на границах ячеек. Наконец, мы описываем этапы постобработки для дальнейшего улучшения результатов обнаружения и сегментации.
(ResNet) [33] обеспечивают высочайшую производительность в задачах классификации естественных изображений и обнаружения объектов.Из-за ограниченного числа классов объектов (например, клеток или ядер), пониженного фонового шума изображений флуоресцентной микроскопии по сравнению с естественными изображениями и требований времени выполнения, вызванных экспериментами с высокой пропускной способностью, сокращенный ResNet-50 используется в качестве магистральная архитектура для нашей сети сегментации. Чтобы ускорить обучение, количество фильтров, а также количество строительных блоков в архитектуре ResNet было уменьшено вдвое, что привело к примерно в десять раз меньшим параметрам по сравнению с исходным ResNet-50.В таблице 1 подробно показана сокращенная архитектура ResNet-50. Эта архитектура была обучена классификации изображений. Предварительно обученная сеть для изображений RGB здесь не подходит, так как входы — это одноканальные изображения для ядер и клеток соответственно. Таким образом, мы преобразовали набор данных ImageNet [34] в оттенки серого. Основываясь на 1-канальном наборе данных ImageNet, базовая модель была обучена для 120 эпох с использованием пакетной нормализации [35].
На рис. 3 показаны архитектуры для сегментации клеток на основе экземпляров с использованием различных способов интеграции информации ядра.Архитектура на рис. 3а вообще не содержит никакой информации о ядре. По сути, это маска R-CNN, обученная на масках ячеек для обнаружения объектов одного класса. Подобно ранней схеме слияния, изображение ядра добавляется в качестве дополнительного канала к изображению клетки и подается непосредственно в Mask R-CNN (рис. 3b). Однако эта архитектура не может использовать доступную достоверную информацию для ядра канала во время процесса обучения.
Ядра обычно имеют схожие формы и размеры, и в большинстве случаев они четко отделимы друг от друга по сравнению с внешним видом клеток макрофагов.Поэтому мы разработали нашу модель сегментации клеток в два этапа. На первом этапе мы обучаем модель для сегментации ядра, чтобы получить полезные функции ядра для задачи сегментации клетки (рис. 2, фиолетовый). Эта архитектура Mask R-CNN, использующая пирамиды функций на основе сокращенной магистрали ResNet-50, обучена для сегментации ядра.
На втором этапе изученные особенности FPN задачи сегментации ядра включаются в архитектуру сегментации клеток с использованием слияния пирамид признаков (FPF).На каждом уровне пирамиды функций мы получаем стек активаций, который объединяется в архитектуру сегментации ячеек в соответствующем масштабе. Это означает, что на каждом этапе пирамиды признаков доступны предварительно обученные признаки ядер клеток, которые можно использовать во время обучения в дополнение к картам признаков для сегментации клеток (рис. 2, зеленый цвет). За исключением пирамид слитых признаков, архитектура основы для сегментации клеток такая же, как у ResNet-50, что и для сегментации ядра.
Мы также оценили две операции слияния для остаточных и боковых соединений: конкатенацию и сложение.Параметры объединенного ядра фиксируются во время обучения сегментации клеток, что позволяет нам комбинировать обе модели во время вывода для одновременного прогнозирования масок сегментации ядра и клетки. Окончательная модель сегментации клеток имеет два входа: изображение ядра и изображение цитоплазмы. Архитектура модели была реализована в Tensorflow [36] и основана на реализации Mask R-CNN [37].
Поскольку сложнее сегментировать пиксели на границах ячеек, особенно в кластерах ячеек, мы применили схему взвешивания для потери маски, чтобы сфокусировать модель на краях ячеек.Взвешивание аналогично взвешиванию, используемому Ronneberger et al. [22]. Придавая больший вес краям, модель должна научиться более точно предсказывать контуры ячеек, что требует точных и последовательных масок сегментации. Мы вычислили гауссову размытую матрицу весов на основе контуров ячеек в маске сегментации полного изображения. Функция размытия по Гауссу для пикселей x , y определяется как с горизонтальным расстоянием x и вертикальным расстоянием y от начала координат.Мы использовали ядро 25 × 25 и стандартное отклонение σ = 5. Используя матрицу весов, пиксели рядом с граничными пикселями взвешиваются до двух раз выше, чем обычные пиксели, то есть пиксели внутри ячеек. Рис. 4 (d) показывает визуализацию урожая из матрицы весов на основе контуров, вычисленных на рис. 4 (b). Обрезка соответствует маске экземпляра на рис. 4 (c). Он используется для взвешивания потерь маски для предложения коробки, обработанного в ветви маски.
Для дальнейшего повышения производительности обнаружения и сегментации ячеек выполняются следующие шаги постобработки.Во-первых, методы обработки контуров из библиотеки OpenCV используются для обнаружения областей ядра, которые перекрываются более чем одной клеткой. В этом случае объединяются соответствующие маски сегментации ячеек. Во-вторых, для поиска областей ячеек, не охваченных масками сегментации на основе экземпляров, применяется метод сегментации на основе пороговых значений из-за редко возникающих ложных срабатываний или смещенных ограничивающих рамок. Следовательно, прогнозируемые маски сегментации вычитаются из сегментации на основе пороговых значений, морфологические операции и обработка контуров применяются для обнаружения областей, а области, размер которых меньше предварительно определенного порогового значения, отбрасываются.Остальные регионы обрабатываются следующим образом:
В-третьих, области ядра, которые не полностью покрыты областями клетки, используются либо для увеличения перекрывающейся области клетки, либо для создания новой клетки с той же формой, что и ядро.
Однако, чтобы обеспечить справедливое сравнение, в экспериментах не проводилась постобработка по сравнению с другими методами.
В этом разделе исследуется производительность трех сетевых архитектур, показанных на рис. Мы дополнительно сравниваем производительность с производительностью U-Net, чтобы оценить, насколько хорошо работает сегментация без обнаружения (U-Net) по сравнению с обнаружением и сегментацией с архитектурами Mask R-CNN.Чтобы обучить архитектуру U-Net, мы настроили взвешивание промежутков между соседними ячейками (или ядрами, соответственно), чтобы добиться лучших результатов на соответствующих наборах данных, чем с настройками, использованными в исходной статье [22]. Другие параметры обучения, такие как скорость обучения и количество эпох, также были оптимизированы для достижения наилучших результатов. Поскольку модель U-Net не возвращает ограничивающие прямоугольники, контуры ячеек использовались для получения ограничивающих прямоугольников. В пользу U-Net контуры внутри контуров и очень маленькие ограничивающие рамки были проигнорированы в нашей оценке.Кроме того, мы сравниваем производительность со Stardist [12], который обеспечивает самые современные результаты сегментации ядра.
Сначала исследуется архитектура Mask R-CNN на рис. 3a. Без какой-либо информации о ядрах ожидается, что его производительность будет ниже, чем для других архитектур.
Во-вторых, чтобы убедиться, что включение информации ядра действительно полезно, Mask R-CNN расширяется, чтобы принять дополнительный входной канал (рис. 3b). Это простой способ включения информации ядра.Однако он не использует доступные маски сегментации наземной истинности для ядер.
В-третьих, оценивается предлагаемая архитектура слияния пирамиды признаков, показанная на рис. 3c, где признаки пирамиды предварительно обученной модели ядра объединяются с признаками клетки с использованием схемы слияния пирамиды. В рамках этой схемы слияния оцениваются две операции слияния: конкатенация и сложение. Недавняя работа по изучению архитектур CNN предполагает, что операции сложения во многих случаях более полезны, чем операции конкатенации [38].Кроме того, архитектуры слияния пирамид признаков оцениваются в сочетании с взвешенными потерями сегментации, описанными выше.
Уровни магистральной архитектуры были инициализированы предварительно обученными весами из задачи классификации изображений с использованием набора данных ImageNet. Во всех экспериментах для FPF использовались одни и те же предварительно натренированные веса. Для архитектуры на рис. 3b с двумя входными каналами предварительно обученные веса первого сверточного слоя были дублированы и уменьшены вдвое, чтобы не нарушать зависимости весов последующих слоев.
Во всех экспериментах с FPF применялся один и тот же график обучения со скоростью обучения 0,001, импульсом 0,9 и коэффициентом уменьшения веса 0,0001. График обучения следующий: помимо предварительно обученной сегментации магистрали, головы регрессии и классификации обучаются для 100 000 итераций. Затем все слои магистрали глубже conv4 обучаются еще на 250 000 итераций. Наконец, вся сеть обучается на 500 000 итераций со сниженной скоростью обучения 10 −4 .Как потери регрессии, так и потери маски взвешиваются с коэффициентом 2.
Все модели сегментации, кроме конфигурации с двумя входными каналами, были обучены на одноканальных входных изображениях 512 × 512. В процессе обучения к обучающим изображениям применялось увеличение данных, что увеличивает количество обучающих изображений до 497, 355 размером 512 × 512 для каждого канала, содержащего 3, 557, 425 ядер в 4, 288, 104 ячейках. Варианты архитектуры FPF используют одну и ту же модель для функций ядра.Он был обучен с использованием того же ранее описанного расписания обучения для моделей сегментации клеток.
Все модели оценивались на тестовом наборе данных, описанном выше. Кроме того, чтобы убедиться, что FPF работает лучше, особенно для кластерных ячеек, мы создали подмножество тестового набора данных. Это подмножество содержит все кластеры ячеек, встречающиеся на тестовых изображениях, но не отдельные ячейки. Полученные 78 изображений имеют размер 256 × 256 пикселей. Каждое изображение содержит как минимум один кластер из двух или более ячеек.Всего набор данных содержит 255 ячеек с 258 ядрами.
Во-первых, мы оценили производительность модели ядра, используемой в архитектурах FPF (как описано в таблице 1), Stardist и U-Net. В таблице 2 показаны результаты как для обнаружения, так и для сегментации с точки зрения AP на тестовых изображениях ядер. Результаты обнаружения и сегментации аналогичны, так как большинство ядер круглые и изолированные. Однако в некоторых случаях ядра оказываются смежными.Эти экземпляры трудно разделить для U-Net, который не может быть обучен обнаружению экземпляров перед сегментацией. Stardist работает немного лучше для сегментации, в то время как Mask-RCNN работает немного лучше для обнаружения.
Затем производительность архитектуры без какой-либо информации о ядре, архитектура с двумя входными каналами и архитектуры FPF оцениваются для обнаружения и сегментации ячеек. Далее ⊙ используется для объединения, а ⊕ — для сложения. Эксперименты проводятся на всем наборе тестовых данных ячеек, а также на подмножестве тестовых данных ячеек, которое содержит исключительно сгруппированные ячейки, чтобы более внимательно изучить те экземпляры, которые трудно обнаружить и сегментировать.
баллов AP для обнаружения и сегментации в наборе данных тестирования ячеек показаны в таблицах 3 и 4 соответственно. Как и ожидалось, эффективность сегментации клеток намного хуже, когда знания о ядрах вообще не учитываются. Просто добавив еще один входной канал для сигнала ядра в Mask R-CNN (см. Рис. 3b), можно достичь значительно лучших результатов. Для модели U-Net тот же метод используется для интеграции канала ядра, т.е. модель имеет два, а не один входной канал.У архитектуры U-Net для набора данных тестирования ячеек два недостатка. Во-первых, он не может использовать доступную наземную истинность ядер напрямую, а во-вторых, в этом наборе данных даже больше трудно разделимых сигналов, чем в наборе данных ядра. Поскольку Stardist обучен только сегментации клеток, он не может использовать информацию о ядрах. Однако Stardist по-прежнему работает хуже, чем модель Mask R-CNN без информации о ядре. По сравнению с показателями Stardist на тестовом наборе ядер, это, скорее всего, вызвано неправильной формой ячеек и сгруппированных ячеек.
FPF работает лучше, чем просто использование дополнительного входа для Mask R-CNN. Однако это не зависит от операции слияния: слияние функций путем конкатенации или добавления приводит к аналогичной производительности. Показатели AP для обнаружения (таблица 3) и сегментации (таблица 4) аналогичны для всех конфигураций слияния пирамид. Хотя средняя производительность AP немного лучше для обеих архитектур, обученных с учетом взвешенных потерь, более высокий вес краев на промежутках между ячейками и пикселями, близкими к границе, в функции потерь не приводит к значительному увеличению производительности ни при обнаружении, ни при сегментации. .По сравнению со средней AP модели без какой-либо информации о ядре, наиболее эффективная архитектура FPF (FPF ⊕ со взвешенными потерями) обеспечивает прирост производительности 10,25%. По сравнению с моделью с входным каналом ядра, относительный прирост производительности составляет 3,02%. Точно так же прирост производительности при обнаружении составляет 10,48% (без ядра) и 3,5% (входной канал ядра). Подробная оценка, включая количество истинных положительных (TP), ложноположительных (FP) и истинно отрицательных (FN) результатов сегментации для порога IoU, равного 0.75 показано в Таблице 5.
Превосходная производительность архитектур FPF становится очевидной, когда они оцениваются на подмножестве сгруппированных ячеек (таблицы 6 и 7): относительное улучшение производительности на 23,88% (без ядра) и 4,43% (входной канал ядра) для обнаружения с точки зрения означает AP. На рис. 6 показаны результаты сегментации сгруппированных ячеек. На рис. 7 показана визуализация масок сегментации, предсказываемых моделью без информации о ядре, с каналом ядра и наиболее эффективной архитектурой FPF.
Рис 7. Визуализация сегментации сгруппированных ячеек.
Вверху: сигнал ядра (a), сигнал цитоплазмы (b) и базовая истинная сегментация (c). Внизу: сегменты экземпляров, предсказанные для модели без информации о ядре (d), с каналом ядра (e) и FPF ⊕ с взвешенными потерями (f).
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008179.g007
Аналогично сегментации FPF ⊕ с взвешенными потерями работает лучше. Относительное улучшение производительности — 23.17% по сравнению с моделью без информации о ядре и 4,16% по сравнению с моделью с входным каналом ядра, как с точки зрения среднего AP. На рис. 8 показан пример сегментации, выполняемой FPF ⊕ с взвешенными потерями на кластере макрофагов. Эксперименты показывают, что U-Net здесь не подходит, а архитектура FPF на основе экземпляров работает намного лучше. Хотя Stardist хорошо работает для сегментации ядра, производительность значительно ниже для сегментации клеток.
С помощью дополнительной постобработки среднее значение AP обнаружения в наборе данных сгруппированных ячеек улучшено до 0.65, а среднее значение AP сегментации увеличивается до 0,682. Для среднего AP обнаружения это относительное улучшение на 31,58% (без ядра) и на 10,92% (входной канал ядра). Для среднего значения AP сегментации это относительное улучшение на 24,45% (без ядра) и на 5,25% (входной канал ядра).
Время выполнения модели FPF составляет около 222 мс на изображение при использовании Tensorflow Serving на сервере с видеокартой Nvidia Geforce GTX 1080 Ti.
В этой статье мы представили новый подход к глубокому обучению для обнаружения и сегментации клеток, основанный на слиянии ранее обученных функций ядра на различных уровнях пирамиды функций.Предлагаемая архитектура слияния пирамид функций явно превосходит современный подход Mask R-CNN для обнаружения и сегментации ячеек на нашем сложном наборе данных с кластеризацией ячеек с относительным повышением средней точности до 23,88% и 23,17% соответственно. В сочетании с этапом постобработки результаты могут быть дополнительно улучшены до 31,58% для обнаружения и 24,45% для сегментации соответственно.
Код, набор данных и модели общедоступны. Набор данных доступен по адресу https: // box.uni-marburg.de/index.php/s/N934NJi7IsvOphf. Код и модели доступны по адресу https://github.com/umr-ds/feature_pyramid_fusion.
Есть несколько направлений для будущей работы. Во-первых, может быть интересно совместное использование весов позвоночника для построения модели, которую можно обучить от начала до конца для обнаружения и сегментации ядра / клетки. С этой целью отдельные заголовки Mask R-CNN для ядер и клеток должны быть присоединены к архитектуре для генерации, регрессии, классификации и сегментации предложения области.Во-вторых, необходимо исследовать интеграцию потери сегментации всего изображения в дополнение к обнаружению и потере сегментации на основе экземпляров. В-третьих, оптимизация стратегий выборки якорных ящиков для ядер и клеток может привести к дальнейшему повышению производительности.
К концу этого раздела вы сможете:
Клетки делятся на две большие категории: прокариотические и эукариотические.Преимущественно одноклеточные организмы из доменов Бактерии и Археи классифицируются как прокариоты ( про — = ранее; — карион — = ядро). Клетки животных, клетки растений, грибы и простейшие являются эукариотами ( eu — = верно).
Все клетки имеют четыре общих компонента: 1) плазматическую мембрану, внешнее покрытие, отделяющее внутреннюю часть клетки от окружающей среды; 2) цитоплазма, состоящая из желеобразной области внутри клетки, в которой находятся другие клеточные компоненты; 3) ДНК, генетический материал клетки; и 4) рибосомы, частицы, синтезирующие белки.Однако прокариоты несколько отличаются от эукариотических клеток.
Рисунок 1. На этом рисунке показана обобщенная структура прокариотической клетки.
Прокариотическая клетка — это простой одноклеточный (одноклеточный) организм, в котором отсутствует ядро или любая другая мембраносвязанная органелла. Вскоре мы увидим, что у эукариот это значительно отличается. Прокариотическая ДНК находится в центральной части клетки: затемненная область, называемая нуклеоидом (рис. 1).
В отличие от архей и эукариот, бактерии имеют клеточную стенку из пептидогликана, состоящую из сахаров и аминокислот, а многие из них имеют полисахаридную капсулу (рис. 1).Клеточная стенка действует как дополнительный слой защиты, помогает клетке сохранять свою форму и предотвращает обезвоживание. Капсула позволяет клетке прикрепляться к поверхностям в окружающей среде. У некоторых прокариот есть жгутики, пили или фимбрии. Жгутики используются для передвижения. Пили используются для обмена генетическим материалом во время типа воспроизводства, называемого конъюгацией. Фимбрии — это белковые придатки, которые бактерии используют для прикрепления к другим клеткам.
В природе взаимосвязь между формой и функцией очевидна на всех уровнях, включая уровень клетки, и это станет ясно, когда мы исследуем эукариотические клетки.Принцип «форма следует за функцией» встречается во многих контекстах. Например, птицы и рыбы имеют обтекаемые формы тела, которые позволяют им быстро перемещаться в среде, в которой они живут, будь то воздух или вода. Это означает, что, в общем, можно вывести функцию структуры, глядя на ее форму, потому что они совпадают.
Эукариотическая клетка — это клетка, которая имеет связанное с мембраной ядро и другие связанные с мембраной компартменты или мешочки, называемые органеллами, которые выполняют специализированные функции.Слово эукариотическое означает «истинное ядро» или «истинное ядро», имея в виду присутствие в этих клетках связанного с мембраной ядра. Слово «органелла» означает «маленький орган», и, как уже упоминалось, органеллы обладают специализированными клеточными функциями, так же как органы вашего тела имеют специализированные функции.
При диаметре 0,1–5,0 мкм прокариотические клетки значительно меньше эукариотических клеток, диаметр которых варьируется от 10 до 100 мкм (рис. 2). Небольшой размер прокариот позволяет ионам и органическим молекулам, которые входят в них, быстро распространяться в другие части клетки.Точно так же любые отходы, образующиеся в прокариотической клетке, могут быстро уйти. Однако более крупные эукариотические клетки развили различные структурные адаптации для улучшения клеточного транспорта. Действительно, большой размер этих клеток был бы невозможен без этих приспособлений. В общем, размер ячейки ограничен, потому что объем увеличивается намного быстрее, чем площадь поверхности ячейки. По мере того, как ячейка становится больше, ячейке становится все труднее и труднее получать достаточное количество материалов для поддержки процессов внутри ячейки, потому что относительный размер площади поверхности, через которую должны транспортироваться материалы, уменьшается.
Рис. 2. На этом рисунке показаны относительные размеры различных типов ячеек и клеточных компонентов. Взрослый человек показан для сравнения.
Прокариоты — это преимущественно одноклеточные организмы из доменов Бактерии и Археи. Все прокариоты имеют плазматические мембраны, цитоплазму, рибосомы, клеточную стенку, ДНК и не имеют мембраносвязанных органелл. У многих также есть полисахаридные капсулы. Прокариотические клетки имеют диаметр от 0,1 до 5,0 мкм.
Подобно прокариотической клетке, эукариотическая клетка имеет плазматическую мембрану, цитоплазму и рибосомы, но эукариотическая клетка обычно больше прокариотической клетки, имеет истинное ядро (то есть ее ДНК окружена мембраной) и имеет другую мембрану. -связанные органеллы, которые позволяют разделить функции.Эукариотические клетки обычно в 10-100 раз больше прокариотических клеток.
1. Опишите структуры, характерные для прокариотической клетки.
1. Прокариотические клетки окружены плазматической мембраной и имеют ДНК, цитоплазму и рибосомы, как и эукариотические клетки. У них также есть клеточные стенки и может быть клеточная капсула. Прокариоты имеют одну большую хромосому, не окруженную ядерной мембраной.Прокариоты могут иметь жгутики или подвижность, пили для конъюгации и фимбрии для прикрепления к поверхностям.
Сорок три набора данных scRNA-seq были получены из 32 исследований 17,18,29,30,31,32,33,34,35,36 , 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54 , для которых обработаны данные экспрессии, такие как количество считываний, уникальные молекулярные количество идентификаторов (UMI), число считываний на килобазу на миллион (RPKM) или транскриптов на миллион килобаз (TPM) было доступно (см. раздел «Методы» и Дополнительные данные 1 и 2 для получения подробной информации).На рис. 1а представлен обзор тщательно отобранных наборов данных с точки зрения типов тканей образца и количества доступных типов клеток на ткань. Из 43 наборов данных 11 были основаны на образцах людей, а 32 — на образцах мышей. Было два относительно больших набора данных о мышах, охватывающих множество тканей и органов: Tabula Muris 18 и Mouse Cell Atlas 17 , в то время как 29 наборов данных были специфичными для образцов мозга (7 для человека и 22 для мыши, включая мозг эмбриона и плода. образцы).
Рис. 1Обзор тщательно подобранного набора данных scRNA-seq и сравнение наборов данных. a Доступные типы тканей образцов и количество типов клеток, определенных в каждом наборе данных scRNA-seq. Отображаемое количество типов ячеек — это максимально возможное количество типов ячеек в наборе данных после удаления неинформативных меток типов ячеек. b Парная ранговая корреляция Спирмена средней экспрессии по типам клеток между наборами данных
Сначала мы оценили сходство профилей экспрессии scRNA-seq между независимыми наборами данных, сравнив среднюю экспрессию каждого гена в разных типах клеток, что представляет собой общий ген. выражение набора данных.Чтобы учесть пакетные эффекты между наборами данных, среднее выражение для каждого набора данных было ранжировано по 100 ячейкам, и ранговая корреляция Спирмена была вычислена для всех возможных пар из 43 наборов данных (см. Раздел «Методы»). Корреляции между наборами данных в пределах одного и того же вида были значительно выше, чем между разными видами (двусторонний тест Манна-Уитни U — p = 3,1e-5 и p = 1,3e-24 для человека и мыши, соответственно) . В основном это было обусловлено высокой внутривидовой корреляцией наборов данных по головному мозгу ( p = 7.2e-7 и p = 1,3e-36 для человека и мыши). Как и ожидалось, на рис. 1b показано четкое разделение между наборами данных, специфичными для мозга, и не специфичными для мозга, в которых корреляции в наборах данных, специфичных для мозга, были значительно выше, чем корреляции между наборами данных, специфичными для мозга и не специфичными для мозга, независимо от вида ( p = 1.0e − 82). Кроме того, наборы данных, относящиеся к мозгу человека, показали значительно более высокую корреляцию с наборами данных, относящимися к мозгу мыши, чем с наборами данных, не относящимися к мозгу человека ( p = 1.1e − 2), и наоборот для мыши ( p = 8,3e − 11). Мы также наблюдали значительно более высокие корреляции в наборах данных, не связанных с мозгом, чем между наборами данных, специфичными для мозга и не связанными с мозгом ( p = 2,9e-15). Однако для наборов данных, не связанных с мозгом, мы не смогли оценить, имеют ли наборы данных более сильную корреляцию в пределах одного типа ткани, чем между типами тканей из-за ограниченной доступности.
Затем образцы экспрессии генов, специфичные для типов клеток, были оценены в 43 наборах данных.Сначала регрессировали среднее выражение по типам ячеек в наборе данных, а затем ранжировали остаток в 100 ячеек для каждого типа ячеек в наборе данных. Для всех возможных пар типов ячеек в 43 наборах данных была вычислена ранговая корреляция Спирмена и спроецирована на двухмерную карту с использованием t-SNE 55 (см. Раздел «Методы»). Затем каждый тип клеток был вручную отнесен к одной из шести основных категорий типов клеток (то есть нейронам, глиальным клеткам, микроглии, эндотелиальным клеткам, иммунным клеткам и другим) на основе исходной клеточной метки (см. Дополнительные данные 3 для t-SNE. координаты и аннотации).Для трех типов клеток головного мозга (нейроны, глиальные клетки и микроглия) корреляции профилей клеточно-специфической экспрессии были значительно выше для каждого из трех типов клеток, чем для этих трех типов клеток головного мозга (двухсторонний критерий Манна-Уитни U p <1.0e-323 для всех трех типов клеток; рис. 2а). Мы также обнаружили, что эндотелиальные клетки, обнаруженные в наборах данных, специфичных для мозга, были сгруппированы вместе с глиальными клетками и показали значительно более высокую корреляцию с глиальными клетками, чем с другими эндотелиальными клетками, которые были обнаружены в наборах данных, не связанных с мозгом ( p <1.0e − 323; Рис. 2а). Типы клеток из наборов данных, не относящихся к мозгу, сформировали большой кластер, который отличается от типов клеток, специфичных для мозга. Внутри кластера, не относящегося к мозгу, иммунные клетки, как и эндотелиальные клетки, как правило, сгруппированы вместе, которые показали более сильную корреляцию внутри каждого типа клеток, чем между другими типами клеток из наборов данных, не связанных с мозгом ( p <1.0e- 323 как для иммунных, так и для эндотелиальных клеток). Эти результаты показывают, что в этих 43 наборах данных паттерны экспрессии для конкретных типов клеток очень похожи, что позволяет предположить, что типы клеток примерно сопоставимы в наборах данных, включая человеческие ресурсы и ресурсы мыши.Мы также наблюдали, что одни и те же типы клеток имели тенденцию группироваться вместе в разных типах тканей (или определенных областях мозга) образцов (дополнительный рис. 1).
Рис. 22D-проекция сходства типов клеток на основе экспрессии специфичных для клеток генов. Каждая точка данных представляет тип ячейки из набора данных. Есть 2679 точек данных, и они окрашены в шесть основных категорий типов ячеек ( a ), набора данных ( b ) и видов образцов ( c ).Полные результаты доступны в дополнительных данных 3
. Мы отмечаем, что типы ячеек из одного исследования (или наборы данных, созданные в одной лаборатории) имели тенденцию группироваться вместе в пределах одного и того же общего типа ячеек (рис. 2b). Кроме того, типы клеток одного и того же вида имеют тенденцию образовывать кластер в пределах одной и той же категории типов клеток (рис. 2c). Это ясно указывает на наличие сложных пакетных эффектов в наборах данных. Поэтому в этом исследовании мы не пытаемся напрямую интегрировать несколько наборов данных scRNA-seq, а обходим эту проблему, проводя условный анализ, чтобы обеспечить систематическое сравнение наборов данных.
Чтобы проверить, сходятся ли варианты риска для определенного признака с конкретным типом клеток, мы провели анализ свойств гена MAGMA, где свойства гена в этом случае определяются значениями экспрессии гена. в конкретном типе клеток. Основанные на генах значения P , полученные из результатов GWAS, были предварительно вычислены с помощью MAGMA для 26 хорошо выраженных ( N > 10 000) признаков из нескольких доменов признаков (см. Раздел «Методы»).Анализ свойств гена направлен на проверку взаимосвязи между экспрессией генов, специфичных для определенного типа клеток, и ассоциациями болезней и генов 10,56 , которая основана на следующей регрессионной модели:
$$ Z = \ beta _0 + E_c \ beta _E + A \ beta _A + B \ beta _B + \ varepsilon $$
(1)
, где Z представляет собой основанный на гене показатель Z , преобразованный из основанного на гене значения P (полученного из анализа генов MAGMA), B представляет собой матрицу нескольких технических искажающих факторов (таких как длина гена и корреляция между генами на основе LD) включена по умолчанию 56 .N E_j $$
(3)
, где n — количество ячеек в типе ячейки c , e i — значение выражения ячейки в типе ячейки c (например, количество UMI или CPM), N — это количество типов ячеек в наборе данных, а C = {тип ячейки 1, тип ячейки 2,…, тип ячейки N }. В модели A (средняя экспрессия по типам клеток) добавляется как дополнительная ковариата для определения специфичности клеток 10 (дополнительное примечание 1 и дополнительный рис.2). Мы выполнили односторонний тест ( β E > 0), который, по сути, проверяет положительную взаимосвязь между клеточной специфичностью и генетической ассоциацией генов. Обратите внимание, что A зависит от доступных типов ячеек и их распределения в наборе данных, а также влияет на определение специфичности ячеек. Этот вопрос обсуждается более подробно в следующем разделе.
Мы сравнили нашу регрессионную модель MAGMA с регрессионной моделью, ранее применявшейся Skene et al. 19 , где значения экспрессии были преобразованы в объединенное значение специфичности типа клетки для значения экспрессии гена, которое представляет собой пропорциональную экспрессию гена в типе клетки относительно суммы всех типов клеток (обозначается здесь как специфичность ( S ) для отличия от значения выражения E , используемого в нашей модели) 19 . Мы показали, что модель Skene et al. завышает результаты анализа свойств генов MAGMA, поскольку разделенные S-баллы могут иметь сильную положительную корреляцию со средней экспрессией по типам клеток (дополнительный рис.3). Это говорит о том, что ассоциации переменных балльной оценки S уязвимы для смешения из-за общего эффекта экспрессии генов, что очень затрудняет получение надежных выводов относительно специфичности типа клеток (см. Раздел «Методы», дополнительное примечание 2 и дополнительные рисунки. 3–5). Поэтому мы считаем, что корректировка средней экспрессии по типам клеток независимо от значения экспрессии, специфичного для клетки, имеет решающее значение для определения специфичности клеток.
Кроме того, часто встречаются гены с нулевым или очень близким к нулю значением экспрессии во всех или в большинстве клеток в наборе данных scRNA-seq.Не всегда известно, действительно ли эти гены не экспрессируются или экспрессируются на уровнях, которые невозможно точно измерить с помощью современных технологий. Присутствие генов с низкими значениями экспрессии влияет на распределение значений экспрессии, специфичных для типа клеток. Решение о том, как их лечить, может непреднамеренно повлиять на результаты анализа обогащения типа клеток. Модель, которую мы предлагаем здесь, показала очень похожие результаты, независимо от включения или исключения значений с низким уровнем экспрессии, и, таким образом, не зависит от искаженного распределения значений экспрессии и не требует исключения значений с низким уровнем экспрессии (дополнительный рис.6).
Затем мы сравнили наш подход с двумя ранее предложенными методами, которые направлены на определение специфичности типа клеток для признака с использованием сводной статистики GWAS: регрессия оценки LD (LDSC) 5 и RolyPoly 6 (подробности см. В разделе «Методы»). . Мы обнаружили, что как LDSC, так и RolyPoly приводили к менее значимым ассоциациям тип-тип клетки по сравнению с моделью регрессии MAGMA (дополнительные рисунки 7 и 8 и дополнительное примечание 3). Таким образом, мы приходим к выводу, что модель регрессии MAGMA может быть предпочтительнее.Тем не менее, мы отмечаем, что каждый из этих методов проверяет несколько разные гипотезы, и может быть полезно сравнить результаты нескольких инструментов (дополнительное примечание 3).
Как упоминалось ранее, интеграция наборов данных scRNA-seq в нескольких исследованиях является сложной задачей из-за сложных эффектов партии и выборки. Здесь мы предлагаем рабочий процесс, который позволяет сравнивать профили экспрессии генов для конкретных типов клеток из разных наборов данных scRNA-seq, которые в значительной степени связаны с признаком, с использованием условного анализа, чтобы избежать необходимости прямой интеграции профилей экспрессии генов.Рабочий процесс состоит из трех этапов, как показано на рис. 3.
Рис. 3Блок-схема анализа специфичности типа клеток с использованием нескольких ресурсов scRNA-seq с помощью MAGMA
На первом этапе анализ специфичности клеток MAGMA выполняется для каждого из 43 наборов данных scRNA-seq отдельно с использованием описанной выше регрессионной модели. Коррекция множественного тестирования применяется к результатам для всех протестированных типов ячеек в наборах данных (дополнительное примечание 4 и дополнительный рисунок 9).
Второй шаг — это условный анализ набора данных.Часто бывает, что в наборе данных scRNA-seq определено несколько похожих типов ячеек, особенно при высоком разрешении типов ячеек. Профили экспрессии генов этих типов клеток, как правило, сильно коррелируют друг с другом, и когда тип клеток сильно связан с признаком, неясно, отражает ли это подлинное участие этого типа клеток или есть искажения из-за экспрессии. в другом типе клеток коррелировал с ним. Условный анализ, следовательно, важен для выявления взаимосвязей между типами ассоциированных с признаками клеток 10 .На шаге 2 выполняется систематический пошаговый условный анализ для каждого набора данных путем установки пороговых значений для пропорциональной значимости (PS) условного значения типа ячейки P относительно маргинального значения P (PS a , b = −log10 ( p a, b ) / — log 10 ( p a ), где p a — крайний P -значение для типа ячейки a и p a, b — условное P -значение типа ячейки a кондиционирование для типа ячейки b ).Результаты покажут, какие типы ячеек следует сохранить или отбросить на последнем этапе (см. Раздел «Методы» и дополнительную таблицу 1, а также ссылку 10 для подробностей).
Последний шаг — выяснить отношения между существенно связанными типами ячеек в наборах данных. Хотя абсолютные значения экспрессии генов в разных наборах данных нельзя напрямую сравнивать, условный анализ перекрестных наборов данных (CD) позволяет нам проверить, в какой степени профили значимой экспрессии генов, обнаруженные в разных наборах данных, отражают одни и те же или похожие сигналы ассоциации.Анализ выполняется для всех возможных пар КД значимых типов клеток, оставшихся со второго этапа (подробности см. В разделе «Методы»). Затем PS условного значения P CD типа ячейки относительно маргинального значения P CD вычисляется для каждого типа ячейки из всех возможных пар. На этом этапе попарный условный анализ предоставляет обзор независимых кластеров сигналов, связанных с признаком.
Чтобы получить представление о типах клеток, участвующих в различных признаках, мы выбрали итоговую статистику GWAS для 26 признаков из шести областей заболеваний (сердечно-сосудистые, иммунологические, метаболические, когнитивные, неврологические и психиатрические черты), которые хорошо обоснованы (размер выборки> 10 000) и широко изучены как с точки зрения генетики, так и с точки зрения патологических путей (дополнительная таблица 2).
Сначала мы провели анализ генов MAGMA для 20 260 генов, кодирующих белок, экстрагированных из Ensembl v92 (GRCh47) с окнами размером 1 т.п.н. с обеих сторон. Обратите внимание, что мы подтвердили, что результаты анализа генов не очень чувствительны к размеру окна генов (дополнительный рис. 10). Впоследствии мы выполнили анализ специфичности клеточного типа, следуя трем шагам, описанным выше. Для шага 1 поправка Бонферрони использовалась для 43 наборов данных; Всего было протестировано 2679 уникальных комбинаций наборов данных и типов ячеек, установив порог значимости на уровне P bon = 0.05/2679 = 1,87e − 5. Чтобы оценить дополнительную ценность наборов данных scRNA-seq по сравнению с традиционными наборами данных RNA-seq, специфичными для тканей, мы вычислили тканевую специфичность для этих 26 признаков, используя данные RNA-seq из GTEx v7 (53 типа тканей; см. Раздел «Методы» и Дополнительные данные 4).
Сначала мы оценили сходство паттернов ассоциации типов клеток по 26 признакам (см. Раздел «Методы»). В целом, мы наблюдали, что признаки в одном домене имели тенденцию демонстрировать сходную специфичность клеточного типа, за исключением признаков в метаболическом домене, которые не образовывали единый кластер (рис.4а). Кроме того, паттерны ассоциаций клеточного типа в трех конкретных областях (когнитивной, неврологической и психиатрической), как правило, очень похожи. Суммируя долю значительно ассоциированных типов клеток с использованием шести основных категорий типов клеток, мы обнаруживаем, что признаки сердечно-сосудистой системы имели тенденцию демонстрировать значительную связь в эндотелиальных и глиальных клетках, иммунологическом домене в иммунных клетках и микроглии, а также в когнитивных, неврологических и психических заболеваниях. домены в нейрональных клетках (рис.4б). Количество существенно связанных типов клеток на каждом этапе и независимых сигналов суммировано в таблице 1 для 26 признаков, а полные результаты представлены в дополнительных данных 5. Для каждого из кластеров признаков подразумевались определенные типы клеток, как подробно описано ниже.
Рис. 4Сходство паттернов ассоциации типов клеток по 26 признакам. a Парная ранговая корреляция Спирмена ассоциации типов ячеек P -значения из шага 1. Признаки группируются на основе парной корреляционной матрицы с использованием иерархической кластеризации. b Значительно ассоциированная основная категория типов клеток по признаку. Тепловая карта окрашена в соответствии с долей значимо связанных типов клеток ( P <0,05 / 2679) в каждой категории типов клеток для каждого признака. Признаки, не имеющие существенной связи, окрашены в серый цвет, и признаки расположены в том же порядке, что и a . Цветовая полоса справа от тепловой карты представляет собой область характеристик. P -значения для конкретных типов клеток на каждый признак доступны в дополнительных данных 5
Таблица 1 Сводка клеточной специфичности для 26 признаковНа основании данных GTEx, ишемическая болезнь сердца (ИБС), диастолическое артериальное давление ( ДАД) и систолическое кровяное давление (САД) показали наиболее значительную связь с тканью артерии, высокое кровяное давление (АД) с маткой и шейкой матки, а частота пульса (PR) с тканью сердца (дополнительные данные 4).Из анализа клеточной специфичности четыре признака (CAD, HBP, DBP и SBP) показали сильную связь с эндотелиальными или другими сосудистыми клетками из нескольких наборов данных (таблица 1 и дополнительный рисунок 11a). Условный анализ показал, что эти ассоциации эндотелиальных клеток в нескольких наборах данных в основном не были независимыми (Рис. 5a и Дополнительный Рис. 12a – c), что указывает на то, что связь с эндотелиальными клетками поддерживается множеством независимых наборов данных. Мы также наблюдали ассоциацию астроцитов с ИБС, что подтверждает ранее сообщенное участие астроцитов в ИБС 57 .PR показал более сильную связь с сердечными мышечными клетками в сердце и гладкими сосудистыми клетками, чем с эндотелиальными клетками (таблица 1 и дополнительный рисунок 12d).
Рис. 5Попарный перекрестный анализ условных наборов данных для ишемической болезни сердца ( a ) и шизофрении ( b ). Тепловая карта условного анализа парных перекрестных наборов данных (шаг 3) для типов ячеек, сохраненных с шага 2. Типы ячеек помечаются с использованием их общего имени с дополнительной информацией в скобках (которая необходима при обратном обращении к метке из исходного исследования. ).Индекс набора данных указан в квадратных скобках. Тепловая карта асимметрична; ячейка в строке i и столбце j — это пропорциональная значимость (PS) перекрестных наборов данных (CD) для типа ячейки j , обусловленная типом ячейки i . CD PS вычисляется как -log 10 (условное значение CD P ) / — log 10 (маргинальное значение CD P -значение). Размер квадрата меньше (80%), когда 50% маргинальной ассоциации типа ячейки в столбце j объясняется добавлением среднего выражения набора данных в строке i (перед условием выражения ячейки тип и ).Звездочки на тепловой карте представляют пару коллинеарных типов ячеек. Двойные начала на тепловой карте представляют CD PS> 1. Столбчатая диаграмма вверху показывает маргинальное значение P для типов ячеек на оси x , а звездочки представляют независимо связанные типы ячеек. Типы ячеек сгруппированы по их независимости, и в каждом кластере типы ячеек упорядочены по их маргинальному значению P . Например, есть четыре независимых ассоциации в ( a ), и типы клеток без звезды не являются независимыми от ассоциации первого независимого типа клеток (со звездой) слева от нее.Полные результаты доступны в дополнительных данных 5. Тепловая карта для других признаков доступна на дополнительном рисунке 12
Все пять признаков в этом домене (воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), рассеянный склероз (РС), ревматоидный артрит (РА), системная красная волчанка (СКВ) и диабет 1 типа (СД1) были связаны с тканями, обогащенными иммунитетом (например, цельной кровью и селезенкой), с использованием данных GTEx (дополнительные данные 4). Все эти признаки показали, на основе наборов данных scRNA-seq, ассоциацию по крайней мере с одним из подтипов В-клеток из наборов данных с множеством тканей (таблица 1, дополнительные рис.11b и 12e – i). Патогенез аутоиммунного / иммуноопосредованного заболевания В-клеток широко известен 58,59,60 . Кроме того, мы обнаружили независимые ассоциации микроглиальных клеток с пятью признаками (Supplementary Fig. 12e – i), обеспечивая дополнительную поддержку недавно включенной роли микроглии в аутоиммунных заболеваниях 61,62,63 .
Черты в когнитивной, неврологической и психиатрической областях, как правило, демонстрируют сильную связь с несколькими областями мозга на основе данных GTEx (дополнительные данные 4).Используя наборы данных scRNA-seq, EA, IQ, NEU и SCZ показали самую сильную ассоциацию с широко определенными нейронами из Tabula Muris FACS (TMF; дополнительный рис. 11c). Эти черты также обнаруживают ассоциацию с множественными подтипами нервных клеток из множества наборов данных, и большая часть этих ассоциаций либо управляется, либо совместно объясняется широко определенными нейронами из TMF (Fig. 5b and Supplementary Fig. 12j-l). Однако несколько подтипов нейронов показали независимые сигналы.Например, SCZ и IQ показали ассоциацию с независимым кластером возбуждающих нейронов (рис. 5b, дополнительный рис. 12k). SCZ также показал связь с подклассом тормозных нейронов в образцах заднего мозга (HBINh3), независимыми от возбуждающих нейронов (рис. 5b). Кроме того, ГАМКергический нейрон и латеральный нейробласт из образцов эмбрионального мозга (Linnarsson GSE76381) показали независимый кластер в EA, IQ, NEU и SCZ. Ранее сообщалось об ассоциации общих типов нейрональных клеток с некоторыми из этих признаков 19,20,21 , однако здесь мы впервые показываем независимые ассоциации специфических возбуждающих, тормозных и эмбриональных нейронов.
Большое депрессивное расстройство (БДР), бессонница (ISM) и субъективное благополучие (SWB) показали связь с тормозящим нейроном бокового коленчатого тела человека, безымянным веществом из мозга мыши и нейронами в слое 5 зрительной коры головного мозга мыши соответственно ( Дополнительные данные 5). Для болезни Альцгеймера (БА) мы обнаружили уникальный паттерн ассоциации клеточного типа, предполагающий роль микроглии (дополнительные данные 5). Для синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ), эпилепсии (EPL) и внутричерепного объема (IV) мы не обнаружили каких-либо значимых ассоциаций клеточного типа (дополнительные данные 5).
Из пяти признаков метаболического домена ИМТ и ожирение (OB) показали связь с мозгом, в то время как WHR показал самую сильную связь с жировой тканью с использованием набора данных GTEx (дополнительные данные 4). Основываясь на анализах клеточной специфичности, BMI и OB показали очень похожие паттерны ассоциации клеточного типа с EA, IQ, NEU и SCZ, которые были в значительной степени связаны с широко определенными нейронами из TMF (дополнительный рис. 11d). Ранее предполагалось участие центральной нервной системы в этих метаболических признаках 8 .Кроме того, как BMI, так и OB показали значительную ассоциацию с тормозящими нейронами, которые не зависят от ассоциаций с другими типами нейрональных клеток (дополнительный рис. 12m, n). С другой стороны, WHR продемонстрировал специфичность определенного клеточного типа по сравнению с другими метаболическими признаками (рис. 4) с независимыми сигналами в эндотелиальных клетках, гладких сосудистых клетках и мезенхимальных клетках (дополнительный рис. 12o). Процент жира в организме и хроническое заболевание почек не показали значительной связи с каким-либо типом клеток (дополнительные данные 5).
Мы также предоставляем пошаговую интерпретацию результатов трех этапов рабочего процесса анализа для трех конкретных признаков (CAD, IBD и SCZ) в дополнительном примечании 5.
В исследованиях, объединяющих наборы данных scRNA-seq со сводной статистикой GWAS для определения типов клеток, имеющих отношение к признаку (включая это исследование), специфичность типа клетки определяется экспрессией гена данного типа клетки относительно общей экспрессии генов в наборе данных. (е.грамм. средняя экспрессия по типам клеток) 5,6,19 . Следовательно, специфичность типа ячеек зависит от тестируемых типов ячеек в наборе данных и от решения, какие типы ячеек включить в анализ. Например, специфичность типа клеток в наборе данных, относящемся к головному мозгу, относится к общей экспрессии генов в головном мозге, тогда как в наборе данных для нескольких тканей она относится к общей экспрессии генов в разных тканях. Чтобы оценить, влияет ли средняя экспрессия на ассоциации типа-признака и каким образом, мы сравнили ассоциации нейрональных клеток и иммунных клеток в контексте различий в типах клеток, включенных в анализ (подробности см. В разделе «Методы»).
Мы наблюдали снижение значимости ассоциации нейронов из набора данных с несколькими тканями (TMF), когда мы кондиционировали в среднем только по типам клеток мозга по сравнению со всеми типами клеток (рис. 6a). Это объясняет для признаков, связанных с мозгом, более сильные ассоциации нейронов из TMF по сравнению с ассоциациями с нейронными клетками из других наборов данных, специфичных для мозга. Для набора данных, специфичных для мозга, ассоциация определенного подтипа возбуждающего нейрона (TEGLU4 из набора данных Mouse Brain Atlas (MBA)) немного снизилась за счет кондиционирования средней экспрессии только для типов нейронных клеток, в то время как большее снижение было замечено когда он был обусловлен средней экспрессией только по возбуждающим нейронам (рис.6б). Поскольку 81% определенных типов клеток в наборе данных MBA являются нейрональными клетками, среднее значение по всем типам клеток уже может быть смещено из-за экспрессии нейронов, поэтому снижение значимости обусловливания в среднем для нейрональных клеток было минимальным. Действительно, когда распределение типов клеток сбалансировано (см. Раздел «Методы» для подробностей), значимость ассоциаций возрастает (Рис. 6c). С другой стороны, значительное снижение значимости при кондиционировании в среднем по всем возбуждающим нейронам указывает на то, что ассоциация TEGLU4 в значительной степени затруднена общей экспрессией возбуждающих нейронов (рис.6б).
Рис. 6Эффекты общего выражения, обусловленного в регрессионной модели. a Ассоциация P -значений нейрона из Tabula Muris FACS, обусловливающая среднюю экспрессию во всех доступных типах клеток из множества тканей (розовый) или только в типах клеток мозга (синий). b Ассоциация P -значений TEGLU4 (возбуждающий нейрон из коры) из Mouse Brain Atlas, обусловливающая среднюю экспрессию во всех доступных типах клеток (розовый), только типах нейронных клеток (синий) или только возбуждающих нейронах (зеленый) . c Ассоциация P -значений TEGLU4 (подтип возбуждающих нейронов коры) из Mouse Brain Atlas, обусловливающих среднюю экспрессию во всех доступных типах клеток (розовый) или случайно выбранных 35 типов клеток (включая TEGLU4) с равномерным распределением семь классов типов ячеек (синие). d Ассоциация P -значений B-клеток костного мозга из Tabula Muris FACS, кондиционирующая среднюю экспрессию для всех доступных типов клеток (розовый) или только типов иммунных клеток в образцах костного мозга (синий).Проценты, отображаемые на синих и зеленых столбцах, представляют собой пропорциональную значимость (шкала в логарифме 10 ) по сравнению с розовыми столбиками. Уровень образования EA, шизофрения SCZ, интеллект IQ, индекс массы тела BMI, невротизм NEU, ожирение OB, бессонница ISM, ревматоидный артрит RA, рассеянный склероз MS, сахарный диабет 1 типа, воспалительное заболевание кишечника IBD
Аналогичным образом ассоциации костного мозга B -клетки из набора данных с несколькими тканями (TMF) уменьшились в результате кондиционирования в среднем только для типов иммунных клеток, определенных в образцах костного мозга (рис.6г). Это предполагает, что ассоциация B-клеток с этими иммунологическими признаками частично объясняется общей экспрессией иммунных клеток.
Подводя итог, можно сказать, что сила ассоциаций типов ячеек очень чувствительна к определению специфичности типа ячеек, которая зависит от распределения типов ячеек, доступных в наборе данных. Это может сделать величину эффектов сильно различающейся в зависимости от характеристик, типов ячеек и наборов данных. Кондиционирование общей экспрессии гена изменяет определение специфичности клеточного типа и тем самым меняет точную проверяемую гипотезу.Крайне важно знать, какая именно гипотеза проверяется с учетом распределения типов ячеек, доступных в наборах данных.
Потребность в понимании процессов развития клеток породила множество вычислительных методов для обнаружения иерархий из данных scRNAseq. Однако существующие методы основаны на евклидовой геометрии, что является неоптимальным выбором для моделирования сложных траекторий клеток с несколькими ветвями.Чтобы преодолеть эту фундаментальную проблему представления, мы предлагаем карты Пуанкаре, метод, который использует мощь гиперболической геометрии в области анализа данных отдельных ячеек. Гиперболическая геометрия, которую часто понимают как непрерывное расширение деревьев, позволяет встраивать сложные иерархические данные только в двух измерениях, сохраняя при этом попарные расстояния между точками иерархии. Это позволяет проводить прямой исследовательский анализ и использовать наши вложения в широком спектре последующих задач анализа данных, таких как визуализация, кластеризация, определение происхождения и псевдовременной вывод.По сравнению с существующими методами — неспособными решить все эти важные задачи с помощью одного встраивания — карты Пуанкаре создают современные двумерные представления траекторий клеток в нескольких наборах данных scRNAseq. Более конкретно, мы демонстрируем, что карты Пуанкаре позволяют прямо формулировать новые гипотезы о биологических процессах, неизвестных предшествующим методам.
Заявление о значимости Открытие иерархий в биологических процессах занимает центральное место в биологии развития.Мы предлагаем отображения Пуанкаре, новый метод, основанный на гиперболической геометрии, для обнаружения непрерывных иерархий на основе попарного сходства. Мы демонстрируем эффективность нашего метода на нескольких наборах данных с одной ячейкой в таких задачах, как визуализация, кластеризация, идентификация происхождения и псевдовременной вывод.
Понимание клеточной дифференциации, например, перехода незрелых клеток в специализированные типы, является центральной задачей современной биологии развития. Последние достижения в одноклеточных технологиях, таких как секвенирование одноклеточной РНК и массовая цитометрия, позволили получить важные сведения об этих процессах на основе высокопроизводительных клеточных измерений 1–4 .Поэтому большой спрос на вычислительные методы для точного обнаружения и представления процессов развития клеток на основе больших наборов данных и зашумленных измерений. Это сложная задача, поскольку требуются методы, позволяющие выявить развитие клеток по непрерывным траекториям с древовидными структурами и множественными ветвями (например, как в классическом эпигенетическом пейзаже Уоддингтона 5 ). На пути к этой цели были достигнуты многочисленные успехи в обнаружении и анализе иерархических структур на основе измерений одной ячейки 6 .В частности, методы, использующие допущения об иерархической структуре для визуализации 7–12 , кластеризации 13; 14 и псевдовременного вывода 15; 16 , привели к беспрецедентным успехам в биологии развития. Чтобы визуализировать иерархические отношения в развитии клеток, многие современные методы встраивают измерения клеток в низкоразмерные евклидовы пространства 7; 8; 17; 18 . Однако этот подход ограничен при моделировании сложных иерархий, поскольку низкоразмерные евклидовы вложения существенно искажают попарные расстояния между измерениями.Полученные в результате встраивания проблематичны не только для визуализации, но и для других последующих задач, таких как кластеризация и идентификация происхождения.
Чтобы преодолеть проблемы уменьшения размерности данных в евклидовых пространствах, мы предлагаем карты Пуанкаре, новый метод вычисления вложений в гиперболические пространства. Это дает множество преимуществ. Во-первых, гиперболические пространства можно рассматривать как непрерывный аналог деревьев, который позволяет с низким уровнем искажений встраивать иерархические структуры всего в два измерения 19 .Во-вторых, метрическая структура гиперболических пространств сохраняет способность моделировать непрерывные траектории с использованием попарных расстояний измерений и позволяет использовать полученные вложения в последующих задачах, таких как кластеризация, определение происхождения и псевдовременной вывод. В-третьих, риманова структура гиперболических многообразий позволяет использовать методы оптимизации на основе градиентов, что важно для вычисления вложений крупномасштабных измерений. В-четвертых, пока мы следим за Nickel et al. 20 , чтобы использовать диск Пуанкаре в качестве пространства вложения, мы сначала должны использовать попарные расстояния, полученные из графа ближайших соседей, в качестве обучающего сигнала для построения гиперболических вложений для обнаружения сложных иерархий в данных.
Важным свойством карт Пуанкаре является то, что они позволяют подходить ко всем этим различным задачам с помощью единого вложения , комбинируя идентификацию кластеров, траекторий и иерархий без учителя. Насколько нам известно, это невозможно с существующими методами, которые мы рассмотрим ниже. t-SNE 17 — это современный метод визуализации, который использует локальные сходства для достижения визуального разделения кластеров в данных.Однако t-SNE не сохраняет глобального сходства между кластерами и, следовательно, не гарантирует, что глобальная иерархическая структура будет сохранена. UMAP 18 вычисляет низкоразмерное евклидово представление данных, сохраняющее топологическую структуру. Однако нет никаких гарантий, что существует низкоразмерное представление сложных древовидных топологий в двумерном евклидовом пространстве. Карты диффузии 7 конкретно решают проблему захвата динамики, подобной диффузии, и непрерывного ветвления в данных.Однако он позволяет визуализировать только простые ветвящиеся структуры в двух измерениях. Абстракции графа 21 (PAGA) и Monocle 2 15 — это еще один класс методов для захвата и визуализации иерархических отношений в данных. PAGA создает «абстрактный граф» с узлами, соответствующими разделам данных, и ребрами, представляющими отношения между этими узлами. PAGA не отображает отношения внутри разделов. Однако PAGA может использоваться для инициализации UMAP и ForceAtlas2, как это сделали авторы.Несмотря на то, что ForceAtlas2 22 дает хорошее визуальное представление топологии дерева, он не сохраняет иерархические расстояния. PHATE 23 , метод, который продемонстрировал способность восстанавливать иерархии с несколькими ветвями, также подвержен артефактам искажения евклидовых пространств. Monocle 2 15 навязывает древовидную топологию для данных, используя «обратное вложение графа» в низкоразмерное евклидово пространство. Однако похож на UMAP, такое представление может не существовать для сложных деревьев.SIMLR 10 — это многоядерное обучение, предназначенное для хорошей работы с наборами данных с несколькими кластерами, что делает его плохим выбором для моделирования данных с непрерывными траекториями. Наконец, SAUCIE 10 — это модель автоэнкодера, которая оптимизирована за счет ошибки реконструкции, поэтому ее свойства сохранения локального и глобального сходства теоретически менее понятны.
Наш метод, Отображает Пуанкаре , вдохновлен идеями многообразного обучения и псевдовременного упорядочения 24; 25 .Учитывая характеристики клеток, такие как экспрессия их генов, мы стремимся оценить структуру лежащего в основе древовидного многообразия в три основных этапа (, рис. 1, и методы): во-первых, мы вычисляем связанного k -ближайшего соседа. граф ( k NNG) 26 , где каждый узел соответствует отдельной ячейке, а каждое ребро имеет вес, пропорциональный евклидову расстоянию между элементами двух соединенных ячеек.1 Для обеспечения возможности подключения мы предлагаем простую процедуру, описанную в Онлайн-методы.Цель этого первого шага — оценить локальную геометрию основного многообразия, вокруг которого евклидовы расстояния остаются хорошим приближением. Во-вторых, мы вычисляем глобальные геодезические расстояния из графа k NN, путешествуя между всеми парами точек по взвешенным ребрам. Этот шаг может быть эффективно вычислен с использованием всех пар кратчайших путей или связанных показателей, таких как индекс 27 «относительной доступности леса» (RFA). Цель этого второго шага — оценить внутреннюю геометрию лежащего в основе многообразия.Эти два первых шага обычно используются в обучении многообразию, чтобы аппроксимировать структуру неизвестного многообразия на основе сходства в пространстве признаков 16; 26; 28; 29 . В качестве третьего шага мы вычисляем двумерное вложение для каждой ячейки в круге Пуанкаре, так что их гиперболические расстояния отражают предполагаемые геодезические расстояния. Геометрия диска Пуанкаре позволяет эффективно моделировать непрерывные иерархии. В частности, вложения, расположенные близко к началу диска, имеют относительно небольшое расстояние до всех других точек, представляющих корень иерархии или начало процесса развития.С другой стороны, вложения, которые расположены близко к границе диска, имеют относительно большое расстояние до всех других точек и хорошо подходят для представления листовых узлов. Таким образом, во вложениях Пуанкаре мы ожидаем, что узлы с небольшими расстояниями до многих других узлов будут размещены близко к началу диска. Хотя такие клетки скорее всего из ранней стадии развития, они не обязательно принадлежат корню иерархии ( Supplementary Fig. 4–6 ). Когда известна ячейка, принадлежащая корню, мы выполняем перевод на диске Пуанкаре, чтобы поместить эту ячейку в центр диска, облегчая визуализацию иерархии (см. методы ).
Рисунок 1 Карты Пуанкаре обнаруживают иерархии и ветвящиеся процессы.( a ) Наша цель — восстановить процессы развития клеток, изображенные здесь на ландшафте Уоддингтона. ( b ) Диски Пуанкаре обеспечивают естественную геометрию для сохранения иерархических структур и попарного сходства в двух измерениях. Диски Пуанкаре растут по мере приближения к их границе: все треугольники, изображенные на рисунке, имеют одинаковый размер. ( c ) Карты Пуанкаре сначала оценивают геодезические расстояния, вычисленные из связного графа k-ближайших соседей.Во-вторых, они вычисляют двумерные гиперболические вложения, сохраняющие это сходство. ( d ) Обзор процедуры вложения карт Пуанкаре . Исходя из заданной матрицы признаков, сопоставление Пуанкаре сначала оценивает локальные сходства на основе заданной пользователем метрики локального расстояния (евклидова, косинуса и т. Д.) И ядра Гаусса с настраиваемым параметром σ . Затем локальные сходства использовались для вычисления глобальных близостей в наборе данных. Посредством риманиновской оптимизации дивергенции KL глобальные близости нацелены на сохранение через глобальные расстояния в диске Пуанкаре.
Карты Пуанкаре имеют несколько гиперпараметров для настройки, таких как количество ближайших соседей ( k ), пропускная способность локального ядра для преобразования расстояний в сходства ( σ ) и параметр масштабирования для вычисления сходства в диск Пуанкаре ( γ ). Дополнительный рис. 2 демонстрирует производительность карт Пуанкаре в отношении выбора этих гиперпараметров и для различных случайных начальных чисел.
Далее мы сравниваем карты Пуанкаре с предшествующими современными методами для различных задач анализа отдельных клеток: визуализация и происхождение обнаружение (PCA, Monocle 2 15 , PAGA 21 , карты диффузии 7 , t-SNE 17 , UMAP 18 , ForceAtlas2 22 , SAUCIE 12 , PHATE 23 и 10 ), кластеризацию (Louvain 30 , агломеративное, k-среднее) и псевдовременной вывод (диффузионный псевдовремени 16 ).
Для этой цели мы используем несколько синтетических наборов данных, сгенерированных из известных динамических систем, и четыре набора данных секвенирования одноклеточной РНК, различающиеся по размеру, сложности (количество типов клеток и ветвей) и технологии одноклеточных для сбора данных 2; 3 ; 31; 32 . Мы сравниваем карты Пуанкаре с каноническим деревом гематопоэтических клеток 33 и различными современными встраиваниями ( Дополнительное примечание 2 ).
Сначала мы оцениваем возможности карт Пуанкаре для визуализации данных и уменьшения размерности.Люди не могут воспринимать визуализации в более чем трех измерениях, а третье измерение уже создает дополнительные проблемы для интерпретации. Однако для существующих методов даже трехмерных вложений недостаточно, чтобы охватить лежащую в основе структуру многообразия во многих сложных иерархиях. Здесь мы демонстрируем, что всего лишь двух измерений карт Пуанкаре достаточно, чтобы восстановить иерархию и сохранить глобальное сходство в наборах данных с очень высокой сложностью.Распространенным способом оценки качества встраивания в помеченные наборы данных является использование оценок классификации. Однако этот подход к оценке имеет ограничения в контексте данных по одной ячейке, особенно для восстановления иерархий и непрерывных траекторий развития. Во-первых, довольно часто метки присваиваются с использованием некоторого подхода к обучению без учителя, такого как кластеризация. Это может способствовать развитию метода уменьшения размерности, который лучше согласуется с методом присвоения меток, чем с объективной истиной.Во-вторых, дискретные метки нелегко применить к наборам данных с непрерывными траекториями, где не существует четкого разделения между типами ячеек. В-третьих, он не содержит информации о качестве сохранения глобальных сходств, например положение кластеров относительно друг друга в иерархии. Вместо этого мы используем не зависящий от масштаба критерий качества 34 (см. «Методы» и Дополнительное примечание 2, ), который оказался хорошей метрикой для беспристрастного сравнения вложений.Критерий состоит из оценки двух скалярных значений Q локальных и Q глобальных , отражающих локальные и глобальные свойства набора данных. Мы следуем предположению Lee et al. 34 , что набор данных с одной ячейкой включает гладкое многообразие, и хороший метод уменьшения размерности сохранит локальные и глобальные расстояния на этом многообразии.
Важным результатом наших экспериментов является то, что карты Пуанкаре были единственным методом, который продемонстрировал способность визуализировать правильную структуру ветвления процессов развития для всех наборов данных с точки зрения этого показателя качества ( рис.3 , Дополнительный рис.2 ). Раздельное визуальное сравнение различных вложений ( Дополнительный рис. 4 — 10 ) демонстрирует преимущества превосходной читаемости карт Пуанкаре. Например, в наборе данных Paul et al. 2 только карты Пуанкаре и t-SNE идентифицируют лимфоидный кластер, в то время как эта важная популяция оставалась невидимой во время исследовательского анализа данных при использовании UMAP или ForceAtlas2. Хотя t-SNE хорошо визуализирует отдельные кластеры, Paul et al.набор данных, он игнорирует иерархическую структуру между кластерами (см. также пример в Дополнительный рис. 8 ). Знание о положении вновь идентифицированного кластера в иерархии развития может быть дополнительно использовано для присвоения ярлыков (например, «лимфоидная популяция») или, когда популяция не известна, для разработки экспериментов для проверки морфологических свойств. Наконец, карты Пуанкаре помещают кластер 16Neu ниже 15Mo в иерархии — в отличие от канонической иерархии, где нейтрофилы и моноциты расположены на одном уровне.Этот результат согласуется с анализом Wolf et al. 21 , что указывает на то, что несоответствие происходит из-за неправильной маркировки кластеров.
Последовательное сравнение показателя качества с визуальной проверкой дает хорошее представление о значении показателей качества и свойств внедрения. В частности, для наборов данных с простыми траекториями (например, ToggleSwitch, MyeloidProgenitors) такие методы, как PCA или SAUCIE, показывают высокую производительность, поскольку они хорошо сохраняют локальные сходства.Однако производительность этих методов значительно снижается для наборов данных с множеством различных типов ячеек и ветвей, таких как Planaria и C. elegans. Карты Пуанкаре, в свою очередь, не страдают от этого ограничения ( Рис. 3 ) и значительно превосходят другие методы с точки зрения как локальных, так и глобальных показателей. Это позволяет нам суммировать весь атлас клеток C. Elegans в одну карту Пуанкаре, включающую ( рис. 2, ). Как сообщили авторы в своем первоначальном исследовании, это было невозможно с UMAP с любым выбором параметров.Это делает карты Пуанкаре сильным кандидатом для визуализации одноклеточных атласов. Дополнительный анализ возраста эмбриона на картах Пуанкаре выявил две различные популяции зародышевых линий. Одна из этих субпопуляций расположена близко к границе диска и ближе к типам зрелых клеток, что потенциально отражает транскрипционное разнообразие этой субпопуляции от других клеток на ранних стадиях. Вторая субпопуляция близка к другим клеткам на ранней стадии. Мы случайным образом выбрали ячейку из второй субпопуляции и назначили ее в качестве корня. Рис. 2 (c) демонстрирует относительное расположение типов клеток в иерархии и сравнение псевдовремени Пуанкаре с возрастом эмбриона. Видно, что он достаточно хорошо согласуется с возрастом эмбриона, за исключением очень ранних стадий (<130). Однако линии не полностью синхронизированы, поэтому мы видим значительную вариативность на графике.
Рисунок 2 Анализ атласа клеток C. elegans.( a ) Карта Пуанкаре (без вращения) на случайной подвыборке из 40 000 ячеек и 100 компонентах PCA.Параметры, используемые для встраивания: ( k = 15, σ = 2,0, γ = 3,0). Основные типы ячеек помечаются текстовой легендой, остальные разделены цветом. ( b ) Карты Пуанкаре помещают зрелые типы клеток ближе к границе диска. Две субпопуляции клеток зародышевой линии видны из встраивания. ( c ) Вращение и сравнение карт Пуанкаре относительно случайно выбранных корневых клеток образуют одну из субпопуляций зародышевых линий (ту, которая больше похожа на остальные типы клеток раннего возраста эмбриона).Красная линия — это среднее псевдовременное расстояние для данного возраста эмбриона.
Рис. 3. Сравнение показателей качества внедрения (лучший случай) для различных наборов данных. Карты Пуанкарестабильно работают со всеми синтетическими и реальными наборами данных в нашей оценке. Наборы данных Planaria и C. elegans, которые демонстрируют наивысшую сложность с точки зрения количества ветвящихся траекторий, представляют собой наборы данных, в которых карты Пуанкаре работают значительно лучше, чем другие методы.
В дополнение к этим результатам мы демонстрируем в дополнительных таблицах 1-2 , что карты Пуанкаре могут быть непосредственно применены для достижения современных результатов по кластеризации и псевдовременному выводу.Примечательно, что для псевдовременного вывода результаты сравнимы с диффузионным псевдовремени, но в картах Пуанкаре эти кластеры напрямую доступны как расстояния от корневого узла. Поэтому они не только быстро вычисляются с учетом вложения, но также позволяют интуитивно интерпретировать график карт Пуанкаре с корневым узлом в центре диска Пуанкаре.
В качестве более глубокого тематического исследования мы анализируем набор данных о раннем развитии крови у мышей, ранее изученный Moignard et al. 1 , используя отображения Пуанкаре. Этот набор данных содержит измерения клеток, захваченных in vivo с помощью qRT-PCR на разных стадиях развития: примитивная полоска (PS), нервная пластинка (NP), складка головы (HF), четыре сомита GFP (Runx1) отрицательные (4SG-) и четыре сомита GFP положительные (4SG +) ( Рис. 4 (a) ). Этапы соответствуют разному физическому времени эксперимента между 7-м днем эмбриона и 8,25-м днем. Мы сравниваем наши результаты, полученные с картами Пуанкаре, с исследованием карт диффузии Муаньяра 1 и с реконструкцией псевдовремени диффузии 16 Хагверди.Карты Пуанкаре обеспечивают качественно иную визуализацию процесса развития, где мы можем визуализировать весь спектр неоднородности, возникающей в начале процесса. Ни PCA, ни диффузионные карты не могут обеспечить визуализацию этого процесса. В то время как анализы Муаньяра и Хагверди подозревали асинхронность в процессе развития, ни их применение PCA, ни карты распространения не смогли этого выявить. В частности, предыдущие исследования предполагают, что разделение на эндотелиальные и эритроидные субпопуляции происходит в складке головы.Наш анализ с использованием карт Пуанкаре показывает, что субпопуляционная судьба клеток уже предопределена при первичном ударе. Кроме того, карты Пуанкаре выявляют отдельный кластер, состоящий из смеси клеток на разных стадиях развития ( Supplementary Fig. 12, ). Этот кластер назван «мезодермальными» клетками Moignard et al., Тогда как Haghverdi et al. считает это корнем процесса развития. Однако, как мы демонстрируем на дополнительном рис. 13–14 , назначение этого кластера корнем иерархии привело бы к противоречию с физическим направлением времени.Благодаря визуализации Пуанкаре мы переназначили корень процесса развития самой дальней клетке PS, не принадлежащей к «мезодермальному» кластеру. Мы взяли корневую клетку из PS, чтобы облегчить кластеризацию по углу для обнаружения клонов. Точнее, путем визуального осмотра мы выбрали наиболее «внешнюю» ячейку из кластера PS. Учитывая наш переназначенный корень, мы разделяем набор данных на пять потенциальных родословных (см. методы ), чтобы найти асинхронность в процессе развития с точки зрения выражений маркеров ( рис.4 (б) ). Анализ состава клеток, принадлежащих к каждой линии (, фиг. 4 (c), ), показывает, что эритроидные клетки принадлежат только к линии 0, и эта линия не содержит эндотелиальных клеток. Рис. 4 (d). показывает существенно улучшенное согласие псевдовремени Пуанкаре (с заново назначенным корнем) с экспериментальным временем (стадиями) по сравнению с псевдовременным порядком, предложенным Haghverdi et al. Анализ экспрессии генов основных эндотелиальных и гемогенных маркеров согласуется с известным паттерном активации генов эндотелиальных и эритроидных ветвей ( Supplementary Fig.14-15 ). Рис. 4 (e) также демонстрирует, что основные гемогенные гены эритроидной популяции уже экспрессируются на стадии PS (подробности см. В дополнительном примечании № 3 ) и что различия в экспрессии генов очевидны на всех стадиях между линиями. . Таким образом, наш анализ с использованием карт Пуанкаре предполагает, что судьба эритроидных и эндотелиальных клеток может быть определена уже на начальной стадии.
Рисунок 4( a ) Иерархия развития, предложенная Moignard et al.и Haghverdi et al. ( b ) Повернутая карта Пуанкаре относительно переназначенного корня. Серый кластер представляет собой кластер потенциальных выбросов или «мезодермальных» клеток, как было предложено Moignard et al. Срезы происхождения были получены с помощью карт Пуанкаре (см. Методы). ( c ) Состав обнаруженных клонов с точки зрения наличия клеток с разных стадий развития. ( d ) Упорядочение клеток, предложенное здесь картами Пуанкаре, гораздо лучше согласуется со стадиями развития, чем порядок, первоначально предложенный Haghverdi et al.: мы видим очень четкую корреляцию псевдовремени Пуанкаре с фактическим временем развития. ( e ) Экспрессия основных гемогенных генов. Гемогенные гены эритроидного происхождения экспрессируются уже на стадиях PS и NP.
Быстрый рост популярности и доступности технологий секвенирования одноклеточной РНК стимулировал разработку новых вычислительных подходов для анализа этих данных. Хотя существует множество вычислительных методов, их результаты часто расходятся.Выбор правильного вычислительного инструмента, сделанный на ранней стадии исследовательского анализа данных, продиктует сгенерированные гипотезы о лежащей в основе биологии. Здесь мы продемонстрировали, что карты Пуанкаре выявляют сложные процессы развития клеток, которые остались бы неоткрытыми предшествующими методами. Карты Пуанкаре могут сделать это, используя гиперболическую геометрию и делая минимальные предположения о данных. В то время как любая гипотеза, созданная с помощью вычислительного анализа, должна быть проверена в лаборатории перед преобразованием в убедительные утверждения, правильно выбранный вычислительный инструмент облегчит выбор подходящих экспериментов.
Для этой цели карты Пуанкаре помогают обнаруживать сложные иерархии из данных с одной ячейкой путем встраивания крупномасштабных измерений ячеек в двумерный диск Пуанкаре. Полученные вложения легко интерпретировать во время исследовательского анализа и обеспечивают точное представление сходства в иерархиях из-за лежащей в основе геометрии. Это свойство выделяет карты Пуанкаре среди других встраиваний, поскольку оно позволяет одновременно обрабатывать визуализацию, кластеризацию, определение происхождения и псевдовременной вывод.Карты Пуанкаре не обязательно должны быть ограничены двумя измерениями, и они будут иметь одинаковую реализацию для трех измерений. Однако для наборов данных, использованных в этом исследовании, было достаточно двух измерений; использование большего количества размеров снизит удобочитаемость и усложнит интерпретацию.
Поскольку отображение Пуанкаре включает несколько гиперпараметров и невыпуклую оптимизацию, мы тщательно изучили чувствительность производительности метода к этим параметрам. Подобно большинству разнообразных методов обучения, количество ближайших соседей k будет иметь значительное влияние на производительность метода.Настройка дополнительных гиперпараметров, таких как σ и γ , будет иметь небольшое влияние на производительность метода с точки зрения локальной и глобальной структуры, и обычно их легко выбрать с помощью визуального контроля или измерения качества, не зависящего от масштаба. Наконец, мы заметили, что выбор случайного начального числа не оказал существенного влияния на свойства визуализации.
С помощью карт Пуанкаре мы надеемся привлечь внимание биологического сообщества к гиперболическим вложениям.Благодаря своим выгодным свойствам для моделирования иерархических данных, они могут обеспечить существенные преимущества для широкого круга задач, таких как изучение транскрипционной гетерогенности и развития клонов при раке на основе данных секвенирования одноклеточной РНК и ДНК, реконструкция иерархии развития развития крови и реконструкция ветвящихся траекторий эмбриогенеза. Мы также хотели бы подчеркнуть, что карты Пуанкаре могут быть хорошим кандидатом для встраивания для визуализации клеточных атласов целых организмов, поскольку они способны сохранять глобальное сходство между измерениями.Наконец, отметим, что карты Пуанкаре не ограничиваются анализом scRNAseq, но могут применяться к любому типу данных со скрытой иерархической структурой.
Далее мы обсудим основные этапы нашего метода, то есть оценку близости, которая информативна для иерархической структуры, и вложение этих близости в диск Пуанкаре.
Позвольте быть многомерным набором данных из n образцов x i ∈ ℝ p (e.g., отдельные клетки) с признаками p (например, измерения экспрессии генов).
Чтобы оценить базовую структуру коллектора по расстояниям на графике k NN G , мы можем использовать кратчайшие пути для всех пар или связанные методы, такие как индекс Relative Forest Accessibility (RFA), который определяется следующим образом: Пусть L = D — A обозначает лапласиан графика G , где A ij = w ( i , j ) — соответствующая матрица смежности, а D ii = ∑ j w ( i , j ) — матрица степеней.Матрица RFA P тогда задается как 27
P — это дважды стохастическая матрица, где каждая запись p ij соответствует вероятности того, что покрывающий лес G включает дерево с корнем i , которое также включает j (т. Е. где j доступен из i ) 27; 35 По сравнению с кратчайшими путями индекс RFA имеет то преимущество, что увеличивает сходство между узлами, принадлежащими множеству кратчайших путей.Это может стать важным сигналом для обнаружения иерархических структур, поскольку узлы, которые участвуют во многих кратчайших путях, вероятно, находятся близко к корню иерархии. Во всех экспериментах мы используем индекс RFA для оценки глобальной близости.
Учитывая P , мы стремимся найти вложение y i каждого x i , которое подчеркивает иерархические отношения между выборками.Для этого мы вложили P в двумерное гиперболическое пространство.
Круг Пуанкаре — это риманово многообразие, где — открытый двумерный единичный шар. В этом случае функция расстояния определяется как
.Из уравнения (3) видно, что евклидово расстояние внутри плавно увеличивается относительно нормы y i и y j . Это свойство расстояния является ключевым для изучения непрерывных вложений иерархий.Например, если поместить корневой узел дерева в начало, он будет иметь относительно небольшое расстояние до всех других узлов, так как его норма равна нулю. С другой стороны, листовые узлы могут быть размещены близко к границе шара, так как расстояние между точками быстро растет с нормой, близкой к единице.
Для вычисления внедрения мы используем подход, аналогичный t-SNE 17 , и аппроксимируем вероятности RFA в P через расстояния в пространстве внедрения. В частности, мы определяем подобие q ij между вложениями ν i и ν j как: где .Тогда естественной мерой качества вложения является симметричное расхождение Кульбака-Лейблера между обоими вероятностными распределениями:
Уравнение (5) благоприятствует встраиванию, при котором узлы с небольшими расстояниями до всех других узлов размещаются близко к началу диска. Хотя такие узлы часто соответствуют узлам, близким к корню базового дерева, не гарантируется, что корень является ближайшим вложением к источнику. Однако, когда корневой узел известен, мы можем выполнить изометрическое преобразование всего вложения, которое помещает этот узел в начало координат и сохраняет все расстояния между точками.В частности, чтобы преобразовать диск таким образом, чтобы начало диска Пуанкаре было преобразовано в ν , x преобразовано в
Так как пространственное разрешение увеличивается близко к исходной точке диска, также предоставляется метод «увеличения» различных частей вложения путем перемещения интересующей области в исходную точку.
Гиперболическое пространство — это метрическое пространство, которое позволяет нам вычислять расстояния между любой парой точек.Это делает карты Пуанкаре напрямую применимыми к методам кластеризации, которые полагаются только на измерения попарного (несходства) сходства, такие как спектральная кластеризация, агломеративная кластеризация и кмедоиды.
В качестве наивного подхода для определения происхождения мы предлагаем использовать агломеративную кластеризацию по углу между парой точек на диске Пуанкаре после поворота относительно корневого узла.
«Псевдо-время» обычно называют «мерой того, насколько прогрессирует отдельная клетка в таком процессе, как клеточная дифференцировка» 25 .В качестве псевдовремени Пуанкаре мы предлагаем использовать расстояние от корневого узла в шаре Пуанкаре.
Далее мы обсуждаем функции различных гиперпараметров в картах Пуанкаре и предлагаем типичные диапазоны значений. Число ближайших соседей k отражает среднюю связность кластеров и обычно устанавливается равным k ∈ [15, 30]. Ширина ядра по Гауссу σ отвечает за веса для графа k -NN в исходном пространстве и обычно устанавливается равным σ ∈ [1.0, 2.0]. Температура softmax γ управляет рассеянием вложений и обычно устанавливается на γ ∈ [1.0, 2.0].
Для количественного сравнения эффективности различных подходов к внедрению мы используем критерии качества, не зависящие от масштаба, предложенные Lee et al. 34 Основная идея этого подхода состоит в том, что хороший подход уменьшения размерности будет иметь хорошее сохранение локальных и глобальных расстояний на многообразии, т.е.грамм. ближайших соседей следует размещать вплотную друг к другу, соблюдая при этом большие расстояния между удаленными точками. Ли и др. 34 предложено использовать два скалярных критерия качества Q local и Q global с упором отдельно на низко- и высотно-габаритные качества заделки. Количества Q локальные и Q глобальные варьируются от 0 (плохо) до 1 (хорошо) и отражают, насколько хорошо локальные и глобальные свойства набора данных сохраняются при внедрении (см. подробности в дополнительном примечании 2 ).Чтобы оценить расстояния в многомерном пространстве δ ij , мы используем геодезические расстояния, оцениваемые как длина кратчайшего пути в графе ближайших соседей k . Мы зафиксировали k = 20 для всех наборов данных, поскольку нет объективного способа выбрать правильный k , и визуально результаты выглядели хорошо для всех встраиваний для этого выбора k . Для расстояний в низкоразмерном пространстве мы используем евклидово пространство для всех вложений, кроме отображений Пуанкаре, для которых мы используем гиперболические расстояния.Поскольку все вложения содержат в своих выводах элемент stoachasitcity, мы запускаем каждое вложение три раза с другим начальным значением. Мы запускаем все вложения с другим набором параметров.
Сложность памяти карт Пуанкаре составляет O ( n 2 ), где n — количество выборок. Временная сложность состоит из трех частей: оценка k NNG — O ( n 2 ) (эта часть может быть заменена на FAISS 38 для масштабируемости), оценка RFA — O ( n 2 ) и минимизация KL-дивергенции — O ( neb ), где e — максимальное количество эпох, b — размер партии.Поскольку нам нужно минимизировать KL до сходимости, мы можем заранее оценить количество необходимых эпох. Для всех используемых здесь наборов данных количество эпох было меньше 2000, и мы также использовали раннюю остановку при сходимости. Типичное время работы на 1 GPU для всех малых и средних наборов данных составляет менее минуты, а для больших наборов данных — около 15 минут (Planaria) или 2-3 часа (C. elegans).
В этом исследовании использовалось несколько общедоступных наборов данных: три синтетических набора данных, созданные с помощью Scanpy, Olsson et al.(ID синапса syn4975060), Paul et al. (код доступа GSE72857), Moignard et al. (код доступа GSE61470), Plass et al. (код доступа GSE103633, предварительно обработанные данные доступны на https://shiny.mdc-berlin.de/psca/), Packer et al. (предварительно обработанные данные доступны по адресу https://github.com/qinzhu/VisCello).
L.B., M.N. и А.К. задумал идею. А.К., М.Н. и Д. Л.-П. разработан и реализован вычислительный инструментарий. А.К. провели анализ и биологическую интерпретацию результатов.ФУНТ. способствовал дизайну исследования. М.Н. руководил исследованием. А.К., М.Н. и Д.Л.-П. написал рукопись.
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Переписка с Анной Климовской или Максимилианом Никелем.
Гиперболическое пространство — это риманово многообразие, структура которого хорошо подходит для представления иерархических и древовидных отношений.Для нашей работы это объединяет два важных преимущества: во-первых, метрическая структура гиперболического пространства позволяет нам фиксировать непрерывные иерархические отношения и интерполировать между точками. Во-вторых, в отличие от других метрических пространств, иерархии уже могут быть представлены в двумерном гиперболическом пространстве с небольшим искажением [1, 2, 3, 4].
Существует несколько эквивалентных моделей гиперболического пространства, таких как модель Бельтрами-Клейна, модель Лоренца и модель полуплоскости Пуанкаре.В этой работе мы основываем наш подход на модели диска Пуанкаре, поскольку она лучше всего подходит для визуального анализа. Диск Пуанкаре определяется следующим образом: пусть будет открытым единичным кругом , где || · || обозначает евклидову норму. Тогда круг Пуанкаре соответствует риманову многообразию, т. Е. Открытому единичному кругу, снабженному римановым метрическим тензором где и g E обозначает евклидов метрический тензор. Кроме того, расстояние между точками задается как
Дополнительный рисунок 1.а) Геодезические в модели диска Пуанкаре гиперболического пространства. Из-за отрицательной кривизны пространства геодезические между точками представляют собой дуги, перпендикулярные границе диска. Для изогнутых дуг средние точки ближе к началу диска (p1), чем связанные точки, например (стр. 3, стр. 5). в) Точки (p, q) лежат на поверхности верхнего листа двулистного гиперболоида. Отображение точек гиперболоида (p, q) на круг Пуанкаре.
Граница диска обозначается значком и не является частью многообразия, но представляет собой бесконечно удаленные точки.Геодезические в этом случае являются дугами, ортогональными (а также всем диаметрам). См. Рисунок 1а для иллюстрации.
Из уравнения (1) видно, что евклидово расстояние двух точек в диске Пуанкаре увеличивается по отношению к их расстоянию до начала диска. Это свойство локальности расстояния Пуанкаре является ключевым для непрерывных вложений иерархий. Например, размещение корневого узла дерева в начале его координат будет иметь относительно небольшое расстояние до всех других узлов, поскольку его евклидова норма равна нулю.С другой стороны, листовые узлы могут быть размещены близко к границе диска Пуанкаре, поскольку расстояние между точками с нормой, близкой к единице, быстро растет. Кроме того, уравнение (1) является симметричным, и иерархическая организация пространства определяется исключительно расстоянием точек до начала координат. Благодаря этому свойству уравнение (1) применимо в неконтролируемой настройке, где иерархический порядок объектов не указан заранее. Важно отметить, что это позволяет изучать вложения, которые одновременно фиксируют иерархию объектов (через их норму), а также их сходство (через их расстояние).
Структура риманова многообразия гиперболических пространств позволяет использовать риманов стохастический градиентный спуск (RSGD) [5] для вычисления вложений. В RSGD обновления параметров выполняются через где обозначает отвод из касательного пространства в точке y на многообразие, grad обозначает риманов градиент скалярной функции, а η > 0 обозначает скорость обучения. Вложения могут быть изучены непосредственно в диске Пуанкаре или, альтернативно, в модели Лоренца (которая имеет полезные свойства для стохастической оптимизации).Мы отсылаем к [2] и [4] для подробной процедуры оптимизации на обоих гиперболических многообразиях. Когда оптимизация выполняется в модели Лоренца, мы можем отобразить выученные вложения в диск Пуанкаре через диффеоморфизм, где который сохраняет все геометрические свойства, включая изометрию (см. также дополнительный рисунок 1 ).
Мы сравниваем карты Пуанкаре с несколькими методами, часто используемыми для визуализации: tSNE [6], UMAP [7], диффузные карты [8], абстракции графов (PAGA) [9], ForceAtlas2 [10] и Monocle 2 [11].Для всех конкурирующих методов мы использовали набор параметров из диапазона, предоставленного авторами. Для сравнения визуализаций для каждого метода мы выбрали лучший набор параметров с точки зрения метрики качества, описанной ниже.
Хотя такие методы, как карты диффузии, PAGA и Monocle 2, могут быть использованы опытным пользователем для вывода правильной структуры данных с помощью нескольких итераций постобработки, здесь мы хотели бы продемонстрировать, как карты Пуанкаре извлекают значимые идеи из данных без дальнейшей обработки. Постобработка.Возможность автоматически и за один раз восстанавливать скрытые иерархии делает карты Пуанкаре привлекательным инструментом для анализа ветвящихся процессов и сложных иерархических структур.
Для количественного сравнения эффективности различных подходов к внедрению мы используем не зависящие от масштаба критерии качества, предложенные Lee et al. [12] Основная идея состоит в том, что хороший подход к уменьшению размерности будет иметь хорошее сохранение локальных и глобальных расстояний на многообразии, e.грамм. ближайших соседей следует размещать вплотную друг к другу, соблюдая при этом большие расстояния между удаленными точками. Ниже мы приводим краткое описание того, как вычислить эту метрику. Все подробности можно найти в оригинальной статье Ли и др. [12]
Позвольте быть высокоразмерным набором данных из N образцов x i ∈ ℝ p (например, отдельные клетки) с функциями p (например, измерения экспрессии генов ) и быть низкоразмерным представлением этого набора данных в м = 2 измерениях.Пусть δ ij обозначает расстояние от x i до x j в многомерном пространстве, а d ij обозначает расстояние от y i to y j в низкоразмерном пространстве. Предположим, что δ ij = δ ji и δ ij = d ji .Расстояния можно использовать для вычисления высоких ( R = { ρ ij } 1≤ i , j ≤ N ) и низких ( V = { v ij } 1≤ i , j ≤ N ) размерные ряды между точками: где | A | обозначает мощность множества. Согласно этому определению рефлексивные ранги устанавливаются на ноль, а нерефлексивные ранги принадлежат {1,…, N — 1}.
Матрица совместного ранжирования Q = { q kl } 1≤ k , l ≤ N — 1 определяется как:
Матрица совместного ранжирования содержит всю необходимую информацию о том, как ранги сохраняются в данном низкоразмерном представлении. Как было продемонстрировано Lee et al. [12], матрицу совместного ранжирования Q легко вычислить, и ее можно использовать для вычисления Q NX — не зависящие от масштаба критерии качества для уменьшения размерности для заданного значения K = 1,…, N — 1: где — верхний левый угол матрицы совместного ранжирования. Q NX ( K ) ∈ [0, 1] оценивает общее качество встраивания. По сути, он измеряет сохранность кварталов Карибского бассейна. Идеальное вложение имеет Q NX ( K ) = 1 на каждые K = 1,…, N — 1.
Левая часть Q NX Кривая ( K ) отражает, как сохраняются локальные свойства, а правая часть соответствует сохранению глобальных свойств.Чтобы улучшить удобочитаемость, Ли и др. [12] Предлагаем использовать два скалярных критерия качества Q local и Q global , отдельно ориентируясь на низкие и высокие размерные качества заделки: где K max определяет разделение кривой Q NX и автоматически вычисляется как:
Количества Q локальные и Q глобальные варьируются от 0 (плохо) до 1 (хорошо).
В этой работе для оценки расстояний δ ij в пространстве большой размерности мы используем геодезические расстояния, оцениваемые как длина кратчайшего пути в графе ближайших соседей размером k . Мы зафиксировали k = 20 для всех наборов данных, поскольку нет объективного способа выбрать правильный k, , и визуально результаты выглядели хорошо для всех встраиваний для этого выбора k . Для расстояний δ ij в низкоразмерном пространстве мы используем евклидово пространство для всех вложений, кроме отображений Пуанкаре, для которых мы используем гиперболические расстояния.Поскольку все вложения включают в себя элемент стохастичности на выходе, мы запускаем каждое вложение три раза с другим начальным значением. Мы запускаем все вложения с различным набором параметров в диапазоне, предложенном авторами каждого метода. Дополнительный рисунок 2 демонстрирует сравнение Q локальных и Q глобальных для всех наборов данных, описанных ниже.
Мы использовали критерии качества, описанные выше, и визуальный контроль, чтобы определить устойчивость карт Пуанкаре к выбору гиперпараметров и случайному начальному значению. Дополнительный рисунок 3 (a) демонстрирует, что хорошие значения σ различаются для разных наборов данных. Однако параметр γ имеет менее сильное влияние и скорее контролирует, насколько встраивание будет рассеяно по диску. Мы советуем установить γ на 1.0 или 2.0 в зависимости от размера набора данных: большие наборы данных обычно лучше визуализируются с γ = 2.0 ( Дополнительный рисунок 3 (b-c) ). Дополнительный рисунок 3 (a, d) демонстрирует, что карты Пуанкаре очень устойчивы к случайным начальным значениям и не оказывают значительного влияния ни на качество, ни на визуальную интерпретацию.
Дополнительный рисунок 2. Сравнение локальных и глобальных показателей качества для различных наборов данных.Все вложения были рассчитаны с 3 случайными начальными числами и несколькими различными гиперпараметрами. Мы зафиксировали k = 20 для всех наборов данных для справедливого сравнения.
Для демонстрации производительности карт Пуанкаре мы использовали несколько синтетических наборов данных, доступных в виде записных книжек Jupyter с помощью Scanpy [13]: простой тумблер, миелоидные предшественники и миелоидные предшественники с гауссовыми каплями.Эти наборы данных ранее использовались для демонстрации производительности карт распространения и абстракций графов и представляют собой отличные примеры многообразий с иерархической структурой возрастающих уровней сложности. Все модели состоят из булевых уравнений, которые были переведены в обыкновенные дифференциальные уравнения и смоделированы с помощью Scanpy как стохастические дифференциальные уравнения с гауссовым шумом [14].
Модель простого тумблера [15, 16] — это процесс с двумя ветвями, которые определяются выражением двух маркеров. Дополнительный рисунок 4 демонстрирует, что все конкурирующие методы дают довольно правильные результаты для этой простой задачи. Однако карты Пуанкаре дают более четкое разделение промежуточных состояний конечных судеб (inter1 vs inter2). В этом примере только tSNE, карты диффузии и карты Пуанкаре производят вложения со значимыми попарными расстояниями.
Синтетический набор данных для миелоидной дифференцировки [17] представляет прогресс клеточной дифференцировки общего миелоидного предшественника в одну из четырех различных ветвей: эритроциты, нейтрофилы, моноциты и мегакариоциты. Дополнительный рисунок 5 показывает предоставленные вложения для всех методов. Отображения Пуанкаре производят вложение, которое визуально похоже на другие методы, но не имеет разрывов и перекрытий в траекториях, так как оно сохраняет все попарные расстояния. При известном корне вращение карты Пуанкаре (посредством перевода) позволяет легко считывать иерархию. Карты диффузии производят вложения, согласующиеся с одной главной ветвью, но для разделения остальных потребуется больше евклидовых измерений.Monocle 2 создает древовидную структуру, соответствующую иерархической структуре данных, но не может восстановить временную связь (траекторию) процесса дифференциации клеток.
Третий набор данных показывает стабильность карт Пуанкаре в отношении существования кластеров, не связанных с основным процессом развития клеток. С этой целью мы используем синтетический набор данных миелоидной дифференцировки с двумя гауссовскими пятнами, добавленными, как было предложено Wolf et al. [9] ( Дополнительный рисунок 6, ).Ни один из методов тестирования, кроме ForceAtlas2, не может захватить иерархию.
Чтобы продемонстрировать эффективность карт Пуанкаре на данных последовательности одноклеточной РНК, мы использовали набор данных о миелопоэзе мышей (только дикого типа) от Olsson et al. [18]. Данные были загружены и предварительно обработаны в соответствии с инструкциями Qiu et al. [11]. Обработанный набор данных содержал 532 объекта для 382 ячеек. Были аннотированы девять типов клеток, соответствующих исходному исследованию: HSCP-1 (предшественник гематопоэтических стволовых клеток), HSCP-2, мегакариоцитарный, эритроцитарный, Multi-Lin * (примированный множеством линий), MDP (предшественник моноцитарно-дендритных клеток), моноцитарный , гранулоциты и миелоциты (миелоциты и метамиелоциты).Чтобы получить наилучшие результаты для Monocle 2, мы использовали конвейер анализа, предоставленный авторами (https://github.com/cole-trapnell-lab/monocle2-rge-paper). В качестве эталонной иерархии мы использовали каноническое дерево гематопоэтических клеток [19] (дополнительный рисунок , рисунок 7 (а), ).
Дополнительный рисунок 3. Устойчивость карт Пуанкаре к случайному начальному значению и выбору гиперпараметров для фиксированногоk = 20 (a) Не зависящие от масштаба критерии качества для различных гиперпараметров и трех случайных начальных значений. (b — c) Изменение визуальных качеств вложения для фиксированного σ и меняющегося γ для наборов данных ToggleSwitch (b) и Olsson (c). Красная рамка обозначает наивысший показатель качества. (d) Сравнение устойчивости со случайным начальным числом: σ и γ фиксированы.
Карты Пуанкаре после вращения ( Дополнительный рисунок 7 (b) ) выявляют известную иерархию и предполагают, что часть кластера HSPC-2 фактически соответствует предшественнику мегакариоцитов / эритроцитов (MEP), и что кластер под названием Multi- Lin соответствует предшественнику гранилоцитов / моноцитов (GMP).Также согласно картам Пуанкаре кластер, обозначенный как миелоцит, не принадлежит иерархии или представляет собой зрелое состояние гранулоцитов. Однако проверка этих гипотез требует подробного анализа дифференциального выражения.
Дополнительный рисунок 7 (c) показывает, насколько широко используемые методы, такие как tSNE, искажают попарные расстояния, поэтому делать выводы об иерархиях труднее. Точно так же двух измерений диффузионных карт недостаточно для представления разветвления.Результаты UMAP и ForceAtlas2 в целом согласуются с картами Пуанкаре, но не позволяют делать выводы о тонких иерархических отношениях между кластерами HSCP-1/2 и MDP. Монокль 2 фиксирует глобальное ветвление, но не может отобразить более тонкие отношения: между эритроцитами и мегакариоцитами или гранулоцитами и миелоцитами.
В качестве примера набора данных с несколькими промежуточными популяциями мы используем набор данных, предоставленный Paul et al.[20]. Миелоидные клетки-предшественники разделяли путем сортировки линии c-Kit + Sca1 из костного мозга мыши и секвенировали с помощью MARS-seq. Мы следовали процедуре предварительной обработки данных recipe_zheng17 (Scanpy-recipe [21]), которая выбирает 1000 наиболее вариабельных генов для 2730 клеток. В оригинальном исследовании авторы выделяют 19 кластеров. Мы используем эти метки и каноническое дерево гематопоэтических клеток (дополнительный рисунок , рисунок 8 (а), ) для сравнения производительности всех методов. Мы запускаем все методы, кроме Monocle 2, на 20 основных компонентах предварительно обработанных данных.Для Monocle 2 мы использовали блокнот Jupyter, предоставленный авторами (лимфоидный кластер был отделен, как описано в исходном исследовании).
Дополнительный рисунок 8 (b) показывает вложения, обеспечиваемые отображениями Пуанкаре. Для этого набора данных предполагается, что корень находится в кластере CMP, что не наблюдается. Мы выбрали корень как медоид (относительно расстояний Пуанкаре) кластеров MEP и GMP вместе взятых. Дополнительный рисунок 8 (c) показывает иерархию, которая может быть считана с карты Пуанкаре.Мы хотели бы указать, что Пуанкаре четко отображает отдельные лимфоидные клетки и дендритные клетки как выбросы, что согласуется с каноническим деревом, поскольку они являются частью лимфоидного происхождения. Ни один из других методов (дополнительный рисунок 8 (d) ) не смог зафиксировать этот факт. Карты Пуанкаре также предполагают, что некоторые из кластеров (13-15) могут быть переименованы, чтобы лучше отражать каноническую иерархию. После удаления лимфоидного кластера Monocle 2 захватывает основной клон ветвления между клонами MEP и GMP, но не разделяет дендритные клетки и разрушает кластер эозонфилов.Wolf et al. продемонстрировали, что результаты Монокля 2 без удаления лимфоидного кластера только ухудшаются.
Наконец, карты Пуанкаре помещают кластер 16Neu ниже 15Mo в иерархии. Однако каноническая иерархия показывает нейтрофилы и моноциты на одном уровне. Как отмечают Вольф и др., Мы предполагаем, что это несоответствие происходит из-за неправильной маркировки кластеров.
Чтобы продемонстрировать масштабируемость карт Пуанкаре для больших наборов данных, мы проанализировали весь набор данных Planaria Plass et al.[22]. Набор данных включает 11 отдельных экспериментов, охватывающих в общей сложности 21 612 клеток с помощью капельной транскриптомики отдельных клеток (Drop-seq). Для получения карт Пуанкаре мы использовали предварительно обработанные данные, предоставленные авторами: https://nbviewer.jupyter.org/github/rajewsky-lab/planarian_lineages/blob/master/paga/planaria.ipynb. Предварительно обработанный набор данных состоит из 50 основных компонентов, которые использовались авторами для применения tSNE, PAGA и ForceAtlas2. ( Дополнительный рисунок 9, ) показывает, что карты Пуанкаре согласуются с встраиванием tSNE и ForceAtlas2, значительно превосходят PCA и UMAP и согласуются с аннотацией иерархии PAGA (рисунок 4 в Plass et al.). К сожалению, мы не смогли вычислить SIMLR для этого набора данных из-за времени вычислений.
Набор данных C. elegans от Packer et al. [23] — это самый большой набор данных, использованный в наших экспериментах. Исходный набор данных содержал 84625 отдельных клеток, измеренных с помощью платформы 10x Genomics. Мы использовали предварительно обработанную версию (скорректированная партиями, 100 компонентов PCA) данных, предоставленных авторами по адресу https://github.com/qinzhu/VisCello. В первоначальном исследовании авторы использовали UMAP для визуализации данных.Мы загрузили координаты UMAP, предоставленные авторами, чтобы провести честное сравнение с картами Пуанкаре. Вместе с набором данных было предоставлено 37 аннотированных вручную меток типов ячеек. Мы произвольно уменьшили размер набора данных до 40 000 ячеек. Весь набор данных представляет собой более чем 60-кратную передискретизацию 1341 ветви в эмбриональной линии C. elegans, поэтому понижающая выборка не должна нарушать статистические свойства набора данных. Мы проверили, что отобранные данные содержат все 37 исходных типов ячеек. Дополнительные рисунки 2, 10, 11 демонстрируют, что карты Пуанкаре значительно превосходят все другие методы встраивания. К сожалению, нам не удалось вычислить SIMLR для этого набора данных из-за времени вычислений.
Карты Пуанкаре обеспечивают вложения, полезные не только для визуализации. Поскольку отображения Пуанкаре сохраняют попарное сходство, их вложения подходят для последующих задач, таких как кластеризация. Мы сравнили несколько подходов к кластеризации с использованием карт Пуанкаре и вложения тестов.Мы также обеспечиваем кластеризацию Лувена и кластеризацию в исходном пространстве экспрессии генов. Поскольку наборы данных включают несколько непрерывных траекторий и нет истинного разделения популяций-предшественников из разных ветвей, мы использовали Скорректированный индекс Рэнда (ARI) и оценки Фаулкса-Маллоуса (FMS) для измерения качества кластера.
Показатели FMI по шкале Фаулкса-Маллоуза определяются как среднее геометрическое значение попарной точности и отзыва: где TP — это количество пар точек, которые принадлежат одному кластеру как в истинных метках, так и в предсказанных метках (истинные положительные результаты), FP — количество пар точек, которые принадлежат одним и тем же кластерам в истинных метках, но не в предсказанные метки (ложные срабатывания), а FN — это количество пар точек, которые принадлежат одним и тем же кластерам в предсказанных метках, но не в истинных метках (ложноотрицательные).FMI варьируется от 0 до 1. Высокое значение указывает на хорошее сходство между двумя кластерами.
Более подробную информацию об этих показателях можно найти на сайте : https://scikit-learn.org/stable/modules/clustering.html#clustering-evaluation
Дополнительная таблица 1 показывает результаты кластеризации синтетических наборов данных. Карты Пуанкаре достигают очень близких результатов к кластеризации Лувена и значительно превосходят подходы к кластеризации с использованием других методов встраивания, за исключением встраивания tSNE, которое в сочетании со спектральной кластеризацией дает лучшие результаты.Однако, как мы продемонстрировали ранее, tSNE не сохраняет иерархию и, следовательно, будет менее полезен для других последующих задач.
Мы продемонстрировали производительность псевдовремени Пуанкаре в сравнении с псевдовремени реального времени и диффузионного псевдовремени на синтетических наборах данных. Дополнительная таблица 2 демонстрирует, что псевдовремя Пуанкаре, а также диффузное псевдовремя достигают высоких показателей корреляции с фактическим временем для всех синтетических наборов данных. Это неудивительно, поскольку эти две меры связаны по своей природе.Производительность обоих подходов псевдовременности, вероятно, ограничена конструкцией k NNG.
В наборе данных о миелоидных предшественниках, чтобы получить пару точек, между которыми следует провести интерполяцию, мы сначала выполняем кластеризацию Лувена для сжатого набора данных. Затем мы выбираем два кластера, из которых отбираем соответствующую пару: один кластер, соответствующий зрелым нейтрофилам, и другой кластер, соответствующий ранним предшественникам нейтрофилов.
В Olsson et al. набор данных, мы используем ранее аннотированные кластеры и случайным образом выбираем несколько пар точек, принадлежащих кластеру «HSPC-1», а также кластерам «Multi-lin», «Eryth» и «Meg». Это соответствует потенциальному положению кластера «HSPC-2» в иерархии.
In the Plass et al. В наборе данных Planaria мы удалили предшественников паренхимы. Мы интерполируем исходный кластер паренхиматозных клеток-предшественников и либо «psap + паренхимные клетки», «pgrn + паренхимные клетки», либо «ldlrr-1 + паренхимные клетки».
Что касается сетевой архитектуры, мы использовали 5 полносвязных слоев с нелинейностями ReLU. Для UMAP и ForceAtlas2 мы добавили пакетную нормализацию, так как она показала лучшую производительность.
Мы анализируем набор данных одноклеточной кПЦР раннего развития крови у мышей [24] с использованием карт Пуанкаре. Мы следовали процедуре предварительной обработки данных, описанной в Haghverdi et al.[8].
Сначала мы визуализировали набор данных с картой Пуанкаре, используя метки, соответствующие различным стадиям дифференцировки [24]: примитивная полоса (PS), нервная пластинка (NP), складка головы (HF), четыре сомита GFP-отрицательные (4SG− ) и четыре сомита GFP-положительных (4SG +) ( дополнительный рисунок 12 (а) ). Мы видим одну группу, которая выделяется. Поэтому мы выполняем спектральную кластеризацию с расстояниями Пуанкаре, чтобы разбить этот кластер для дальнейшего анализа ( Дополнительный рисунок 12 (b), (c), ).Затем кластер 4 в основном состоит из ячеек Flk1-Runx1 (см. Дополнительный рисунок 12 (d) ). Moignard et al. [24] называют этот кластер «мезодермальными клетками при первичном поражении» и предполагают, что эти клетки дают начало кровеносным и эндотелиальным клеткам.
Ячейка, которую Haghverdi et al. выбрать в качестве корня дифференциации для диффузионного псевдовременного анализа, принадлежащего к «мезодермальному» кластеру в нашем анализе. Мы визуализируем (, дополнительный рисунок 13, ) псевдовремя диффузии и псевдовремя Пуанкаре с корнями (а), предложенными Haghverdi et al., и (б) наиболее непохожая точка в скоплении PS по расстоянию Пуанкаре. Нежелательно, чтобы расстояния от (а) становились ортогональными по отношению к фактическим стадиям развития. Это согласуется с выводом Haghverdi et al. что такой выбор встраивания не позволяет увидеть асинхронное развитие. Следовательно, кластер 4 может соответствовать не клеткам, ведущим к эндотелиальным клеткам и клеткам крови, а скорее ранним мезодермальным клеткам, которые, в свою очередь, приводят к некоторой другой популяции (дополнительный рисунок 4 в Moignard et al.). Далее мы будем называть кластер 4 «мезодермальным».
Как указано Moignard et al., Развитие крови — очень асинхронный процесс, который трудно зафиксировать с помощью PCA или диффузионных карт. На дополнительном рисунке , рис. 14, мы дополнительно демонстрируем, как карты Пуанкаре могут быть использованы для выявления структуры развития в этом процессе. Сначала мы применяем вращение к карте Пуанкаре, чтобы поместить определенную выше корневую ячейку в центр диска. Затем мы применяем нашу процедуру определения линии передачи и демонстрируем, что внутри каждой линии в среднем сохраняется порядок стадий развития.Однако, если мы посмотрим на все линии вместе взятые, то популяции стадий PS, NP, HF представляются однородной смесью. Следовательно, угловая информация в картах Пуанкаре добавляет дополнительный объем информации, критически важный для понимания асинхронных процессов.
Наконец, мы проанализировали профили экспрессии основных эндотелиальных и гематопоэтических маркеров для различных клонов ( Дополнительная фигура 15, ). Карты Пуанкаре предполагают, что клетки заранее принимают решение о том, какой ветвью стать.В частности, мы предполагаем, что клетки фиксируются в своей будущей ветви уже на стадии PS.
Дополнительный рисунок 4. Сравнение различных вариантов внедрения модели с простым тумблером.Есть две отдельные ветви. Мы дополнительно пометили промежуточные состояния из моделирования. (a) Необработанное отображение Пуанкаре. (b) Вращение отображения Пуанкаре относительно известного корня. (c) Методы эталонного тестирования.
Дополнительная фигура 5. Сравнение различных встраиваний для синтетической модели дифференцировки миелоидных предшественников.Есть четыре различных ветви. Мы дополнительно пометили промежуточные состояния из моделирования. (a) Необработанное отображение Пуанкаре. (b) Вращение отображения Пуанкаре относительно известного корня. (c) Методы эталонного тестирования.
Дополнительный рисунок 6. Сравнение различных встраиваний для синтетической модели дифференцировки миелоидных предшественников (4 различных ветви) с двумя дополнительными гауссовыми кластерами.Мы дополнительно пометили промежуточные состояния из моделирования. (a) Необработанное отображение Пуанкаре. (b) Вращение отображения Пуанкаре относительно известного корня. (c) Методы эталонного тестирования.
Дополнительная фигура 7. Сравнение различных встраиваний для набора данных scRNAseq миелопоэза мыши (Olsson et al.).(a) Каноническое дерево гематопоэтических клеток. Цветные кружки соответствуют цветам населения из набора данных. (b) Отображение Пуанкаре, повернутое относительно корня. (c) Методы эталонного тестирования.
Дополнительная фигура 8. Сравнение различных встраиваний для набора данных MARS-seq предшественников миелоидов мыши (Paul et al.).(a) Каноническое дерево гематопоэтических клеток. Цветные узлы соответствуют цветам населения из набора данных. Белые узлы соответствуют промежуточным аннотированным состояниям. (b) Повернутая карта Пуанкаре относительно корня (медоиды MEP и GMP кластера). (c) Иерархические отношения, предложенные картой Пуанкаре. (d) Методы эталонного тестирования.Для воспроизведения дерева Монокль 2 лимфоидный кластер был удален.
Дополнительный рисунок 9. Сравнение различных встраиваний для набора данных Planaria Drop-seq (Plass et al.).(a) Карта Пуанкаре, повернутая относительно корня (медоиды кластера необласта 1). (b) Методы сравнения.
Дополнительный рисунок 10. Сравнение различных встраиваний для набора данных C. elegans 10X Genomics (Пакер и др.). Дополнительный рисунок 11. Сравнение возраста эмбриона для различных встраиваний C.Набор данных elegans 10X Genomics (Пакер и др.) Дополнительный рисунок 12.(a) Карта Пуанкаре набора данных Moignard. (б) Спектральная кластеризация с расстояниями Пуанкаре. (c) Анализ стадийного состава выделенных кластеров. Кластеры 1 и 3, скорее всего, представляют собой развитие клеток крови. Кластеры 0 и 4 потенциально соответствуют развитию эндотелия. Кластер 2 соответствует кластеру, названному «мезодермальные клетки при первичном ударе» в оригинальной статье. (d) Сравнение средней экспрессии маркеров на стадии PS для кластера 2 с остальными клетками PS. Кластер 4 состоит в основном из Flk1-Runx1-.
Дополнительный рисунок 13.Вращение карты Пуанкаре и соответствующие псевдовремени с корнем, выбранным согласно (a) Haghverdi et al. (b) предлагается новый корень.
Дополнительный рисунок 14. Анализ упорядочения стадий в разных линиях передачи.(а) Карта Пуанкаре с этапами развития. (b) Обнаруженные линии преемственности с кластеризацией по углу в диске Пуанкаре. (c) Линейная композиция по ступеням. (d) Среднее распространение (из Haghverdi et al.) И псевдовремя Пуанкаре на этап для всего набора данных. (e) Среднее псевдовремя Пуанкаре на стадию в индивидуальной линии передачи.
Дополнительный рисунок 15. Экспрессия основных эндотелиальных и гемогенных маркеров, визуализированных на диске Пуанкаре. Дополнительная таблица 1.Сравнение различных подходов к кластеризации на синтетических наборах данных.Более высокие значения означают лучший результат.
Дополнительная таблица 2.Сравнение псевдовремени диффузии (dpt) и псевдотремени Пуанкаре (pmpt) с реальным временем на синтетических наборах данных с использованием коэффициента корреляции Пирсона между. Последний столбец соответствует коэффициенту корреляции между псевдовремени диффузии и псевдотремени Пуанкаре. Чем выше значение, тем лучше.
Мы хотели бы поблагодарить Иоану Санду и Уилла Макнейра за ценные обсуждения.
Обновленная версия содержит дополнительные эксперименты и количественное сравнение качества встраивания с широким спектром методов тестирования.
https://github.com/facebookresearch/PoincareMaps
1 Обычно k NNG для данного k подключать не обязательно. Нам необходимо обеспечить возможность подключения, чтобы восстановить иерархию. Если бы один компонент был отключен от других компонентов, было бы невозможно восстановить его положение относительно других компонентов.
Громов М. Метрические структуры для римановых и неримановых пространств (Springer Science & Business Media, 2007).
Иммунобиология Мерфи, К. и Уивер, К. Джейнвей (Garland Science, 2016).
Шесть королевств | |
Когда Линней разработал свой В системе классификации было всего два царства, растений и животных. Но польза микроскопа привели к открытию новых организмов и выявление различий в клетках.Система двух королевств была no дольше полезно. Сегодня система классификация включает шесть царств. |
Шесть королевств: Растения, животные, простейшие, грибы, архебактерии, Эубактерии . |
Как организмы помещаются в свои царства? Тип ячейки, сложный или простой Их способность готовить еду Номер клеток в их теле | |
Растения Вы, наверное, вполне знаком с членами этого королевства, поскольку он содержит все растения, которые вы узнали — цветущих растений, мхов, и папоротники.Все растения многоклеточные, состоят из сложных клетки. | Дополнительно растений автотрофов, организмов, которые сами производят пищу. |
Насчитывает более 250 000 видов, царство растений — второе по величине царство.Виды растений варьируются от до крошечных зеленых мхов до деревьев-гигантов. | Без растения, жизни на Земле не было бы! Растения питают почти всех гетеротрофов (организмов, питающихся другими организмов) на Земле. Ух ты!
|
Животные животных королевство — самое большое королевство с более чем 1 миллион известных видов . Суматранский тигр — Царство: Animalia, Тип, Chordata, класс Mammalia, отряд Carnivora, семейство Felidae, род Pathera, Вид tigris | Все животные состоят из множества сложные клетки. Это тоже гетеротрофов. Представители животного мира встречаются в большинстве разнообразная среда в мире. |
Архебактерии В 1983 г. инструмент ученых образцы из места в глубине Тихого океана где горячие газы и расплавленная порода вскипели в океане, образовав Землю интерьер. К их удивлению они обнаружены одноклеточные (одна клетка) организмов в образцах. Эти Организмы сегодня классифицируются в королевстве архебактерий. |
|
Архебактерии встречается в экстремальных условиях, таких как горячая кипящая вода и термальный вентилирует в условиях отсутствия кислорода или в сильно кислой среде. | Находка Архебактерии : горячие пружины из Йеллоустон Национальный парк , США , были в числе первых были обнаружены архебактерии. На фото биологи Выше показаны погружаемые предметные стекла микроскопа в бассейн с кипящей водой, на которые архебактерии могут быть пойманы для изучения. |
Эубактерии Подобно архебактериям, эубактерий являются сложными и одноклеточные. Большинство бактерий находится в EUBACTERIA царство. Это те виды, которые можно найти повсюду, и люди их больше всего знаком с. | |
Эубактерии классифицируются в их собственное царство, потому что их химический состав отличается. | Мост эубактерии полезны. Некоторые производят витамины и такие продукты, как йогурт. Однако эти эубактерии, стрептококки, изображенные выше, могут вызвать стрептококковое горло! |
Грибы Грибы, плесень и мучнистая роса все примеры организмов в царстве грибов . Большинство грибов являются многоклеточными, и состоят из множества сложных клеток. Интересные факты о Грибы | |
Некоторые грибы имеют прекрасный вкус, а другие могут убить вас! | Грибы — это организмы, которые когда-то путали биологи. с растениями, однако, в отличие от растений, грибы не могут самостоятельно готовить пищу. Большинство получают пищу из частей растений, которые разлагаются в земля. |
Протисты Слизневые формы и водоросли протисты. Иногда их называют царство случайностей и концов, потому что его члены так отличаются от одного Другая. Протисты включает все микроскопические организмы, которые являются не бактериями, не животных, не растений и не грибов. |
|
Большинство протистов одноклеточных. Вы можете быть интересно, почему эти протисты не классифицируются как архебактерии или Царства эубактерий. Потому что, в отличие от бактерии, протисты — сложные клетки.
| Эти нежные на вид диатомеи классифицируются в протистское царство. |
| | Структура растительной клеткиРастения уникальны среди эукариот, организмов, клетки которых имеют заключенные в мембраны ядра и органеллы, потому что они могут производить себе пищу.Хлорофилл, придающий растениям зеленый цвет, позволяет им использовать солнечный свет для преобразования воды и углекислого газа в сахара и углеводы — химические вещества, которые клетки используют в качестве топлива. Подобно грибам, другому царству эукариот, растительные клетки сохранили защитную структуру клеточной стенки своих прокариотических предков. Основная растительная клетка имеет сходный мотив конструкции с типичной эукариотической клеткой, но не имеет центриолей, лизосом, промежуточных волокон, ресничек или жгутиков, как клетка животных.Однако у растительных клеток есть ряд других специализированных структур, включая жесткую клеточную стенку, центральную вакуоль, плазмодесматы и хлоропласты. Хотя растения (и их типичные клетки) неподвижны, некоторые виды производят гаметы, которые действительно демонстрируют жгутики и, следовательно, могут двигаться. Растения можно разделить на два основных типа: сосудистые и несосудистые. Сосудистые растения считаются более развитыми, чем несосудистые растения, потому что они развили специализированные ткани, а именно ксилему , которая участвует в структурной поддержке и проводимости воды, и флоэма , которая выполняет функцию проводимости пищи.Следовательно, они также обладают корнями, стеблями и листьями, представляющими более высокую форму организации, которая обычно отсутствует у растений, лишенных сосудистой ткани. Несосудистые растения, входящие в подразделение Bryophyta , обычно не более одного-двух дюймов в высоту, потому что у них нет адекватной поддержки, которая обеспечивается сосудистыми тканями для других растений, для роста. Они также больше зависят от окружающей среды, чтобы поддерживать необходимое количество влаги, и, следовательно, имеют тенденцию населять влажные, тенистые места. По оценкам, сегодня в мире насчитывается не менее 260 000 видов растений. Они варьируются по размеру и сложности от небольших несосудистых мхов до гигантских секвойи, крупнейших живых организмов, достигающих в высоту 330 футов (100 метров). Лишь небольшой процент этих видов напрямую используется людьми в пищу, укрытие, волокно и лекарства. Тем не менее, растения являются основой экосистемы и пищевой сети Земли, и без них сложные формы жизни животных (например, люди) никогда бы не смогли развиться.В самом деле, все живые организмы прямо или косвенно зависят от энергии, производимой фотосинтезом, и побочный продукт этого процесса, кислород, необходим животным. Растения также уменьшают количество углекислого газа, присутствующего в атмосфере, препятствуют эрозии почвы и влияют на уровень и качество воды. Жизненные циклы растений включают чередующиеся поколения диплоидных форм , которые содержат парные наборы хромосом в их клеточных ядрах, и гаплоидных форм , которые обладают только одним набором.Обычно эти две формы растений очень непохожи по внешнему виду. У высших растений диплоидное поколение, члены которого известны как спорофитов из-за их способности продуцировать споры, обычно является доминирующим и более узнаваемым, чем поколение гаплоидных гаметофитов . Однако у мохообразных форма гаметофита является доминирующей и физиологически необходимой для формы спорофита. Животные должны потреблять белок для получения азота, но растения способны использовать неорганические формы элемента и, следовательно, не нуждаются во внешнем источнике белка.Однако растениям обычно требуется значительное количество воды, которая необходима для процесса фотосинтеза, для поддержания структуры клеток и облегчения роста, а также в качестве средства доставки питательных веществ в клетки растений. Количество питательных веществ, необходимых растениям, значительно различается, но девять элементов обычно считаются необходимыми в относительно больших количествах. Называемые макроэлементами , эти питательные вещества включают кальций, углерод, водород, магний, азот, кислород, фосфор, калий и серу.Также были идентифицированы семь микроэлементов , которые требуются растениям в меньших количествах: бор, хлор, медь, железо, марганец, молибден и цинк. Считается, что растения произошли от зеленых водорослей, они появились с начала палеозойской эры , более 500 миллионов лет назад. Самые ранние ископаемые свидетельства наземных растений относятся к ордовикскому периоду (от 505 до 438 миллионов лет назад). К году каменноугольного периода , примерно 355 миллионов лет назад, большая часть Земли была покрыта лесами из примитивных сосудистых растений, таких как ликоподы (чешуя) и голосеменные (сосны, гинкго). Покрытосеменные , цветковые растения, не развивались до конца мелового периода , примерно 65 миллионов лет назад, как раз тогда, когда динозавры вымерли.
Организация тканей листа — Тело растения делится на несколько органов: корни, стебли и листья. |